Muster und Wiederholbarkeit von Spulwürmern

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 175 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Kürzlich wurde ein Coproantigen-Enzym-Immunoassay (ELISA) zum Nachweis von Ascarid-Infektionen bei Hühnern vorgeschlagen. Das Ausscheidungsmuster von Ascarid-Antigenen über Hühnerkot und die Konsistenz der Messungen im Verlauf von Infektionen sind derzeit nicht bekannt. Diese Studie bewertet das Muster und die Wiederholbarkeit des Wurmantigens pro Gramm Kot (APG) und vergleicht die diagnostische Leistung des Coproantigen-ELISA mit einem Plasma- und Eigelb-Antikörper-ELISA und McMaster-Kot-Eierzahlen (M-FEC) in verschiedenen Wochen nach der Infektion (wpi).

Kot-, Blut- und Eigelbproben wurden von Legehennen entnommen, die oral mit einer Mischung aus Ascaridia galli- und Heterakis gallinarum-Eiern infiziert waren (N = 108) oder als nicht infizierte Kontrollen gehalten wurden (N = 71). Es wurden Messungen durchgeführt, darunter (a) APG unter Verwendung eines Koproantigen-ELISA, (b) Eier pro Gramm Kot (EPG) unter Verwendung der McMaster-Technik und (c) Ascarid-spezifisches IgY in Plasma und Eigelb unter Verwendung eines Ascarid-spezifischen Antikörper-ELISA). zwischen wpi 2 und 18.

Zeitabhängige signifikante Unterschiede im APG zwischen infizierten und nicht infizierten Legehennen wurden quantifiziert. Bei WPI 2 (t(164) = 0,66, P = 1,00) und 4 (t(164) = −3,09, P = 0,094) wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet, wohingegen infizierte Hühner signifikant höhere APG-Werte aufwiesen als die Kontrollen durch wpi 6 (t(164) = −6,74, P < 0,001). Wie aus einer hohen Gesamtwiederholbarkeitsschätzung von 0,91 (CI = 0,89–0,93) hervorgeht, konnte APG konsistent bei derselben Person gemessen werden. Im Vergleich zu McMaster und dem Antikörper-ELISA zeigte der Koproantigen-ELISA insgesamt die höchste diagnostische Leistung (Fläche unter der Kurve, AUC = 0,93), obwohl die Unterschiede zeitabhängig waren. Von WPI 6 bis 18 hatte der Koproantigen-ELISA eine AUC > 0,95, während der Plasma-IgY-ELISA die höchste diagnostische Leistung in WPI 2 zeigte (AUC = 0,95). M-FEC hatte die höchste Korrelation mit der gesamten Wurmlast, während APG die höchste Korrelation mit Gewichten und Längen von A. galli aufwies.

Die Ascarid-Antigen-Ausscheidung über Hühnerkot kann mit einem Koproantigen-ELISA mit hoher Genauigkeit und Wiederholbarkeit gemessen werden. Die Antigenausscheidung nimmt mit der Zeit zu und ist mit der Reifung des Wurms, insbesondere mit der Größe von A. galli, verbunden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass für eine genauere Diagnose von Infektionen der komplementäre Einsatz verschiedener Diagnosetools erforderlich ist.

Die Förderung von Praktiken, die das Wohlergehen von Legehennen verbessern, führt zu einem zunehmenden Einsatz käfigfreier Haltungssysteme. Wenn Legehennen Zugang zum Freiland gewährt wird, können sie ihr natürliches Verhalten besser zum Ausdruck bringen und haben in einem Freilandhaltungssystem weniger Angst und Stress [1]. Als Folge der Haltung von Hühnern in Haltungssystemen ohne Käfige sind gastrointestinale Nematoden – insbesondere Ascaridia galli und Heterakis gallinarum mit oral-fäkalen Übertragungswegen – weit verbreitet und gehen selbst bei minimalen oder fehlenden klinischen Symptomen mit Produktionsverlusten einher [2, 3,4,5,6,7]. In solchen Systemen stehen Legehennen in engerem Kontakt mit Exkrementen, was die orale-fäkale Übertragung von Helmintheninfektionen ermöglicht [3]. Die Eindämmung der Ausbreitung der Infektionen und die Verringerung ihrer Auswirkungen auf die Produktivität der Hühner hängt weitgehend von einer frühzeitigen und genauen Diagnose ab.

Bei der Auswahl einer Methode zur Diagnose einer Helmintheninfektion bei Nutztieren sind mehrere wichtige Kriterien zu berücksichtigen. Die erste besteht darin, alle infizierten und nicht infizierten Tiere korrekt zu identifizieren und zu unterscheiden (dh qualitative Diagnose). Durch die frühzeitige Erkennung einer Helmintheninfektion kann die Ausbreitung der Infektion innerhalb und zwischen Herden verhindert werden. Dies könnte auch für den Einsatz einer gezielten Herdenbehandlung von entscheidender Bedeutung sein, die möglicherweise kosteneffektiv ist und die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen bei Parasiten abmildern könnte [8]. Das zweite Kriterium besteht darin, dass das Diagnosegerät in der Lage ist, die Infektionsintensität zu beurteilen (d. h. quantitative Diagnose), indem es eine signifikante Korrelation zwischen seinem Messergebnis und der tatsächlichen Wurmlast des Wirtstiers herstellt. Die Schätzung der Infektionsintensität ist für Geflügel und andere Nutztiere wichtig, da die Auswirkungen einer Helmintheninfektion auf die Produktivität, Gesundheit und das Wohlergehen der Tiere wahrscheinlich größer sind, je höher die Wurmlast ist (z. B. [9]). Eine quantitative Diagnose ist auch bei der Prüfung der Wirksamkeit von Anthelminthika unerlässlich, die derzeit auf der Reduzierung der Anzahl fäkaler Eier (FEC) oder der Anzahl der Würmer durch Autopsie beruht [10].

Ein weiteres Kriterium für die Diagnose einer Helmintheninfektion ist die korrekte Identifizierung spezifischer Parasitenarten, die die Infektion verursachen. Allerdings hat die artspezifische Identifizierung im Zusammenhang mit der Tierhaltung möglicherweise nicht immer Priorität, insbesondere weil mehrere Arten gleichzeitig den Wirt infizieren [2, 4, 11] und in der Praxis häufig Breitband-Anthelminthika zur Bekämpfung verschiedener Arten eingesetzt werden Darmwürmer [12]. Unter natürlichen Bedingungen ist bekannt, dass A. galli und H. gallinarum den Hühnerwirt gemeinsam infizieren [11], und ein einziger diagnostischer Test wird als ausreichend angesehen, um die Koinfektionen beider Arten nachzuweisen [13]. Daher sollte diagnostischen Methoden Vorrang eingeräumt werden, die sowohl einen hohen qualitativen als auch einen hohen quantitativen Wert für die Beurteilung einer Nematodeninfektion bei Hühnern haben.

Der Goldstandard zur Beurteilung der Intensität einer Nematodeninfektion besteht darin, die Anzahl der Würmer in verschiedenen Entwicklungsstadien im Wirtsdarm zu zählen, was jedoch eine Obduktion erfordert [14]. Als indirekte Methode wird das Vorhandensein und die Intensität einer Ascarid-Infektion bei Hühnern im Allgemeinen durch mikroskopische Zählung der Parasiteneier im Kot ermittelt, d. h. durch fäkale Eierzählung (FEC) [15]. McMaster- und MiniFLOTAC-Eizähltechniken werden häufig zur Quantifizierung von Nematodeneiern im Kot verschiedener Wirtsarten verwendet. Wie in zwei unabhängigen Studien an Hühnerspulwürmern gezeigt wurde, ist McMaster genauer und schneller als MiniFLOTAC, auch wenn letzteres eine höhere Präzision und Empfindlichkeit bei niedrigen Eizahlen im Kot aufweist [16, 17]. Dennoch kann die Abhängigkeit von der Fruchtbarkeit der Würmer und der Infektionsintensität neben anderen Herausforderungen die Zuverlässigkeit von FECs zur Beurteilung von Nematodeninfektionen beeinträchtigen [18, 19]. Daher wurde die Messung von Ascarid-spezifischem Immunglobulin Y (IgY) im Wirtsplasma und im Eigelb als alternative diagnostische Methode zu FECs vorgeschlagen [13, 20]. Kürzlich haben wir einen Coproantigen-Enzym-Immunoassay (ELISA) eingeführt, der lösliche Ascarid-Antigene im Kot des Hühnerwirts mit hoher qualitativer diagnostischer Genauigkeit quantifizieren kann [21]. Das et al. [22] zeigten, dass die Entwicklung einer humoralen Reaktion gegen A. galli bei Hühnern zeitabhängig ist und Larvenstadien stärker mit der Antikörperstimulation verbunden sind als die adulten Stadien. Solche zeit- und entwicklungsstadiumbedingten Veränderungen sind auch für die Ausscheidung von Wurmantigenen zu erwarten. Die Testleistung sowohl der Antikörper- als auch der Antigen-messenden ELISAs wurde noch nicht verglichen. Darüber hinaus wurden beide ELISAs bislang nur zu einem einzigen Autopsiezeitpunkt bei Patienteninfektionen separat ausgewertet [13, 20, 21]. Daher konnten die Auswertungen keine zeitabhängigen Schwankungen in der Produktion von Antikörpern im Plasma oder im Eigelb sowie in der Ausscheidung von Antigenen über Hühnerkot berücksichtigen. Darüber hinaus gibt es derzeit keinen Bericht über das Muster der Ausscheidung von Wurmantigenen in verschiedenen Infektionsphasen, d. h. darüber, ob Wurmantigene im Wirtskot über einen längeren Zeitraum konsistent bei derselben Person gemessen werden können.

Daher bestand das erste Ziel dieser Studie darin, das Antigen-Ausscheidungsmuster des Kotwurms über einen Zeitraum von 18 Wochen zu beurteilen, um zeitabhängige Veränderungen der Antigen-Ausscheidung aufgrund fortschreitender Durchgängigkeit und erneuter Infektionen zu berücksichtigen. Dazu gehörte auch die Abschätzung der Wiederholbarkeit von Messungen der fäkalen Antigenkonzentration im Wirtskot innerhalb und zwischen verschiedenen Wochen nach der Infektion (wpi). Das zweite Ziel bestand dann darin, die diagnostische Leistung des Koproantigen-ELISA mit verschiedenen diagnostischen Instrumenten zu vergleichen, einschließlich der Anzahl der fäkalen Eizellen und der Messung von Anti-Askaridien-Antikörpern in Plasma und Eigelb. Anschließend wurde die Fähigkeit der Diagnosemethoden zur Abschätzung der Infektionsintensität bei verschiedenen WPI bewertet.

Die Ethikkommission für Tierversuche des Landesamtes für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern hat die Genehmigung für den Versuch erteilt (Genehmigungsnummer AZ.: 7221.3-1-080/16). Das experimentelle Verfahren für Infektionen folgte den Richtlinien der World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology for Geflügel [23]. Umgang mit Tieren, Pflege, Unterbringung in Gehegen und Käfigen, Betäubung, Tötung und Obduktionen wurden von geschultem und autorisiertem Personal gemäß den ethischen Genehmigungs- und Tierschutzregeln durchgeführt.

Für diese Studie wurden Blut-, Eigelb- und Kotproben von insgesamt 179 Legehennen des Genotyps Lohmann Brown Plus (LB, N = 109) und des Genotyps Lohmann Dual (LD, N = 70) verwendet. Die in dieser Arbeit verwendeten Legehennen stammen aus einer früheren Studie [24], in der wir die Toleranz und Resistenz von Legehennen verschiedener Genotypen gegenüber Nematodeninfektionen untersuchten. Die Hennen wurden als 17 Wochen alte Junghennen von einem Versuchsbetrieb (Lehr- und Forschungshof Ruthe, Tierärztliche Hochschule Hannover) bezogen und nach dem Zufallsprinzip in zwei benachbarte Räume mit jeweils sechs Ställen aufgeteilt. In jedem Raum wurden die Hennen in drei Ställen pro Genotyp gehalten (dh jeweils drei Ställe für den LB- und LD-Genotyp). Zu Beginn des Experiments lag die Anzahl der im selben Stall gehaltenen Hennen zwischen 8 und 25, mit einer Anpassung an die Besatzdichte von maximal sechs Hennen/m2. Jede Henne erhielt eine Flügelmarke, um wiederholte Messungen an denselben Individuen im Laufe der Zeit zu ermöglichen.

Im Alter von 24 Wochen wurden die Hennen in sechs Ställen des ersten Raums (N = 108) experimentell mit A. galli und H. gallinarum infiziert, während die Hennen in den sechs Ställen des Nebenraums (N = 71) gehalten wurden als nicht infizierte Kontrollen. Ein Konsortialdiagramm, das die Anzahl der Hennen pro Genotyp und Infektionsstatus, Autopsiezeitpunkte und Probenahmeschemata darstellt, ist in Abb. 1 dargestellt. Bei WPI 0, 2, 4, 8, 12 und 16 wurden insgesamt 29–34 Hennen zufällig ausgewählt Die Küken wurden aus ihren Ställen ausgewählt (d. h. es wurden in allen Ställen Proben mit mindestens einer Henne entnommen) und in Einzelkäfige überführt, wo sie zwei Wochen lang blieben, bevor die einzelnen Eier gesammelt und quantitative Kotproben entnommen wurden (d. h. 24-Stunden-Probenahme). Die Käfige (B 40 × L 45 × H 50 cm) mit Drahtgitterboden wurden auf einer Kotsammelplatte platziert, die eine quantitative tägliche Kotsammlung von einzelnen Hennen ermöglichte. Die Käfige dienten den Hühnern als Ausrüstung für die Wasser- und Futteraufnahme nach Belieben. Nach einer Anpassungszeit von 10 Tagen in den Käfigen wurde der tägliche Einzelkot (g/24 h) von jeder Henne wiederholt an vier aufeinanderfolgenden Tagen vor der Schlachtung quantifiziert. Der tägliche Kot wurde gründlich homogenisiert und Teilproben für Antigenmessungen wurden bei –20 °C gelagert. Nach zwei Wochen Gefangenschaft in den Käfigen, dh bei WPI 2, 4, 6, 10, 14 und 18, wurden alle Käfighennen durch Betäubung mit einem Bolzenschuss und anschließendes Ausbluten getötet. Zu jedem Zeitpunkt, beginnend mit 2 bis 14 WPI, wurden 18 infizierte und 11 Kontrollhennen für die Autopsie getötet, während die restlichen 18 infizierten und 16 Kontrollhennen bei WPI 18 getötet wurden (Abb. 1). Unmittelbar nach der Tötung wurde Schlachtblut in mit Kaliumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) behandelten Röhrchen (Kabe Labortechnik GmbH, Nümbrecht-Elsenroth, Deutschland) gesammelt und die Hennen wurden einer Autopsie unterzogen, um die Wurmbelastung als direktes Maß für die Infektionsintensität zu beurteilen. Die Blutproben wurden 20 Minuten lang bei 2500 × g zentrifugiert und der resultierende Überstand zur späteren Analyse bei –20 °C gelagert. Am letzten Tag der Gefangenschaft oder bei der Schlachtung wurden von jeder Henne einzelne Eier gesammelt. Die entnommenen Eier wurden geöffnet, um das Eigelb zu entnehmen. Eine Teilprobe Eigelb (250 µL) wurde entnommen und mit 1,5 ml gereinigtem Wasser (pH = 2,5) verdünnt und mit einem Vortex-Mischer homogenisiert. Das Eigelb wurde bis zur Analyse bei –20 °C gelagert. Insgesamt wurden daher von allen Legehennen während des gesamten Versuchszeitraums 179 Blut- und Eigelbproben sowie 716 (dh 179 Hennen × 4 Tage) Kotproben erfasst.

Ein Diagramm, das den experimentellen Ablauf mit zeitspezifischen Obduktionen, Stall- und Käfighaltungsplänen und der Anzahl der Hühner, die auf Kot, Blut und Eigelb untersucht wurden, darstellt

Als Einstreumaterial in den Ställen wurden Holzspäne verwendet. Am Tag der Infektion wurde die Einstreu erneuert und anschließend 18 Wochen lang im Stall belassen, um eine anschließende natürliche Infektion zu ermöglichen. Alle Hennen erhielten ein kommerzielles Futter (ad libitum), das 11,2 MJ umsetzbare Energie, 170 g Rohprotein und 3,6 g Kalzium/kg Legehennenfutter enthielt [24]. Die klimatischen Bedingungen in den Räumen wurden mithilfe eines automatischen Systems gesteuert, um eine konstante Temperatur, Licht und Belüftung in allen Ställen sicherzustellen.

Das Infektionsmaterial für das Experiment wurde von weiblichen Würmern gesammelt, die im Darm von freilaufenden Hühnern lebten, die auf natürliche Weise mit Spulwürmern infiziert waren. Das Verfahren zur Wurmgewinnung und -isolierung aus Hühnerdärmen sowie die Embryonierung von Eiern von A. galli und H. gallinarum wurden bereits beschrieben [25]. Für die Embryonierung von A. galli-Eiern wurde 0,1 % Kaliumdichromat (K2Cr2O7) als Inkubationsmedium verwendet, während intakte H. gallinarum-Weibchen etwa 4 Wochen lang in Formalin (0,5 %) bei Raumtemperatur gehalten wurden. Einen Tag vor der Infektion wurden Eier von H. gallinarum aus den Würmern isoliert, wie in Stehr et al. beschrieben. [25]. Zur Vorbereitung des den Hühnern zu verabreichenden Infektionsmaterials wurden die embryonierten Eier beider Arten in einem 36-µm-Sieb gespült und in 0,9 % NaCl in zwei getrennten Eierpools gesammelt (d. h. für A. galli und H. gallinarum getrennt). ) bei Raumtemperatur. Die Eierpools wurden bewertet, um den Prozentsatz der Eier zu bestimmen, die vollständig embryoniert waren [26]. Nach Anpassung der Konzentrationen der embryonierten Eier in der 0,9 %igen NaCl-Lösung (d. h. 500 Eier von A. galli oder H. gallinarum in 0,2 ml NaCl) wurden insgesamt 1000 embryonierte Eier beider Arten in 0,4 ml NaCl gegeben zu jeder Henne. Den Hühnern wurden die infektiösen Eier der beiden Parasiten unter Verwendung einer 5-cm-Ösophaguskanüle in einer Einzeldosis (dh 500 A. galli + 500 H. gallinarum-Eier) inokuliert. Den nicht infizierten Kontrollhennen wurde ein orales Placebo mit 0,4 ml 0,9 % NaCl verabreicht.

Die Wurmbelastung wurde bei Legehennen quantifiziert, die bei WPI 2, 4, 6, 10, 14 und 18 obduziert wurden. Die Hennen wurden vor der Autopsie 3 Stunden lang nüchtern gehalten, um den Magen-Darm-Trakt (GIT) teilweise zu entleeren. Der Gastrointestinaltrakt wurde unmittelbar nach der Autopsie entfernt und der Dünndarm und der Blinddarm, die Prädilektionsstellen von A. galli bzw. H. gallinarum, wurden abgetrennt [24]. Das Jejunum und das Ileum wurden dann in Längsrichtung geöffnet, um den Darminhalt durch ein Sieb zu waschen (Maschenweite: 36 μm und 100 μm bei 2–6 Wpi bzw. 10–18 Wpi). Nach der Entfernung des Darminhalts wurde das Jejunum unter fließendem lauwarmem Leitungswasser gespült und gleichzeitig das Gewebe mit einer feinen Bleistiftzange zusammengedrückt, um die an den Gewebewänden haftenden Lumenwürmer zu entfernen. Die Gewebelarvengewinnung erfolgte nur im Jejunum mittels EDTA-Inkubation [27]. Kurz gesagt, das Jejunum wurde in 400 ml vorgewärmter EDTA-Lösung (10 mM EDTA, 0,9 % NaCl) 22 Stunden lang bei 40 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gewebe in EDTA-Lösung getaucht, um die Larven zu entfernen. Die Lösung wurde durch ein Sieb (Maschenweite: 20 μm) gesiebt, um die Gewebelarven zu sammeln.

Alle von jeder Henne gewonnenen Würmer beider Arten wurden zur Zählung, Geschlechtsdifferenzierung und Längenmessung mit einem Stereomikroskop in Petrischalen gelegt. Die Gesamtzahl der im Dünndarm und Blinddarm vorhandenen A. galli- und H. gallinarum-Würmer wurde separat erfasst. Die Wurmlast wurde auf der Grundlage der identifizierten morphologischen Merkmale der Würmer wie Geschlecht (männlich oder weiblich) und nach Entwicklungsstadium (z. B. Larven, reif, unreif) erfasst [25]. Kurz gesagt, die Identifizierung männlicher Würmer basierte auf dem Vorhandensein von Spicules. Würmer von H. gallinarum wurden als erwachsene Weibchen eingestuft, wenn Eier in der Gebärmutter vorhanden waren. Ascaridia galli-Würmer wurden anhand eines vorgegebenen Grenzwerts (43,5 mm) klassifiziert, um eiförmige Weibchen (> 43,5 mm) von unreifen Weibchen (< 43,5 mm) genau zu trennen [25]. Die Wurmlänge wurde sowohl für A. galli als auch für H. gallinarum mit einem Lineal mit einer Messgenauigkeit von 1 mm gemessen. Die Längenmessung basierte auf der Wurmklassifizierung (d. h. Larven, ausgewachsene, unreife, Männchen). Für jede Klassifizierung wurden nur intakte Würmer (maximal 10 pro Vogel) zufällig ausgewählt und gemessen. Der Durchschnitt der ausgewählten Würmer wurde mit der Gesamtzahl der Würmer in jeder Klassifizierung multipliziert [25]. Das Gewicht (mg) von A. galli wurde anhand der Länge (mm) weiblicher und männlicher A. galli mithilfe des Gewichts-Längen-Beziehungsmodells von Le cren geschätzt [28]. Das durchschnittliche Gewicht von A. galli wurde auch im Hinblick auf die gesamte A. galli-Belastung in jeder Henne berechnet. Um die Gewichts-Längen-Beziehung von Le cren zu ermitteln, verwendeten wir einen Datensatz aus einem früheren Experiment (Zusatzdatei 1: Abb. S1), bei dem sowohl das Gewicht als auch die Länge von A. galli genau gemessen wurden. Zur Messung des A. galli-Gewichts wurde eine Präzisionsanalysewaage (0,1 mg Ablesbarkeit) (Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) verwendet. Die Genauigkeit der Längenmessungen war die gleiche wie in der vorliegenden Studie (dh 1 mm).

Zu jedem Zeitpunkt der Autopsie (d. h. WPI 2–18) wurde eine zufällige Teilprobe (4 g) aus gründlich gemischten täglichen Fäkalien entnommen, die einen Tag vor der Hühner-Autopsie gesammelt und mit der McMaster-Eierzähltechnik analysiert wurden [15]. Als Flotationsflüssigkeit für die 4 g Fäzes wurde eine gesättigte NaCl-Lösung (Dichte = 1,2 g/ml) verwendet, die dann auf 60 ml der Endsuspension aufgefüllt wurde. Der minimale Nachweiswert der Eierzähltechnik wurde auf 50 Eier pro Gramm Kot (EPG) festgelegt. Da Eier von A. galli und H. gallinarum nicht zuverlässig voneinander unterschieden werden können [29] und sich regulärer Kot nach einer 24-stündigen Sammelperiode nicht genau vom Blindkot trennen lässt, wurden sowohl normaler als auch blinder Kot gemischt Spulwürmer-Eier wurden zusammen gezählt.

Homogenisierte Kot-Unterproben, die aus dem täglichen Kot von Hühnern während der letzten 4 Tage der Gefangenschaft entnommen wurden (d. h. n = 4 Proben/Henne), wurden gemäß dem von Oladosu et al. beschriebenen ELISA-Verfahren auf Wurmantigenkonzentration gemessen. [21]. Kurz gesagt, lösliche Antigene von A. galli wurden aus aufgetauten intakten Würmern durch Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 70 % Ethanol isoliert. Anschließend wurden die Würmer im Mörser homogenisiert und mit Basispuffer (35 mM BisTris, 25 mM Tris) extrahiert. Extrahiertes lösliches Antigen wurde zur Immunisierung von Kaninchen zur Antikörperproduktion verwendet. ELISA-Platten wurden über Nacht bei 4 °C mit 100 µl des polyklonalen Anti-Ascarid-Kaninchen-Antikörpers beschichtet, um die Bindung an lösliches Antigen in Stuhlproben zu ermöglichen. Insgesamt wurden 50 mg der täglichen Stuhlproben in Probenpuffer eingewogen und mit einem Vortex-Mischer gründlich gemischt. Der Überstand wurde gesammelt und in Testvertiefungen pipettiert. Ein Aliquot von 100 µl löslichem Antigen mit Konzentrationen von 400, 200, 100, 50, 25 und 0 ng/ml wurde zur Standardisierung ebenfalls in die Testvertiefungen gegeben. Die Platten wurden dann vor den Messungen wiederholt inkubiert und gewaschen. Die Antigenkonzentration im Stuhl wurde dann als Menge an Ascarid-Antigen pro Gramm Stuhl (APG, µg/g Stuhl) basierend auf der Standardkurve für 400, 200, 100, 50, 25 und 0 ng lösliches Antigen/ml gemessen [21 ]. Anti-Ascarid-spezifisches IgY in Plasma und Eigelb wurde mit einem weiteren ELISA quantifiziert [13]. Die Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei 4 °C mit 100 µl des isolierten löslichen A. galli-Antigens beschichtet. Standard-Hühnerserum wurde seriell verdünnt und als Standardkurve im Test verwendet. Die Proben wurden auf die beschichteten Platten gegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten wiederholt gewaschen, gefolgt von einer weiteren 30-minütigen Inkubation mit Enzymkonjugat, einem Waschschritt und einem Abschluss mit Salzsäure. Die Antikörperbindung wurde relativ zum Standard-Hühnerserum mit hoher Antikörperaktivität (1000 mU/ml per Definition) unter Verwendung einer Vier-Parameter-Logistik (4-PL) ausgedrückt [13].

Die Daten wurden basierend auf der Messung jeder Variablen modelliert, dh entweder Einzelmessungen oder wiederholte Messungen eines Wirts im Laufe der Zeit. Die relevanten Parameter der Wurmbelastung (Wurmzahl, Wurmlänge, FEC usw.) wurden zu einem einzigen Zeitpunkt während der Autopsie gemessen, während die Antigenkonzentration in jeder der an vier aufeinanderfolgenden Tagen vor der Autopsie entnommenen Stuhlproben gemessen wurde (Abb. 1). ). APG-, Eigelb-IgY- und Plasma-IgY-Daten wurden nach der logarithmischen Transformation [log(y+1)] analysiert, um die Heterogenität der Varianz zu korrigieren und annähernd normalverteilte Daten zu erzeugen. Eine Beschreibung aller gemessenen Variablen ist in Tabelle 1 dargestellt.

Signifikante Unterschiede in den Antigen- und Antikörperkonzentrationen zwischen infizierten Hühnern und nicht infizierten Kontrollen innerhalb von WPI und ihre Wechselwirkungen wurden mit der Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA) unter Verwendung der PROC MIXED-Funktion der cloudbasierten Software SAS OnDemand for Academics (2021) analysiert SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Die wiederholte Angabe wurde für die Antikörperkonzentration in Plasma und Eigelb ausgeschlossen, da nur eine einzige Messung bei der Autopsie durchgeführt wurde. Das Modell für Antigen- und Antikörperkonzentrationen umfasste die festen Auswirkungen von Infektion, WPI und deren Wechselwirkungen, während Stift, Wirtsgenotyp und Probenahmetag in der Analyse als blockierende Effekte berücksichtigt wurden. Die Kovarianzstruktur wurde für das angepasste Modell auf AR (autoregressiv) (1) eingestellt. Für jeden festen Effekt wurden die Mittelwerte der kleinsten Quadrate berechnet und der paarweise Vergleich wurde mit den Tukey-Kramer-Korrekturen für mehrere Vergleiche getestet. Effekte und Unterschiede wurden bei P < 0,05 als signifikant angesehen.

Der klasseninterne Korrelationskoeffizient (ICC) zwischen den wiederholt gemessenen Proben innerhalb jedes WPI wurde geschätzt, um die Wiederholbarkeit der fäkalen Antigenausscheidung zu bestimmen. In jedem WPI (n = 4 × 29–34 Proben pro WPI) wurden an vier aufeinanderfolgenden Tagen (n = 4 Proben pro Henne) wiederholt Stuhlproben aus beiden Infektionsgruppen zur Quantifizierung der Antigenkonzentration von denselben Legehennen entnommen. ICC-Schätzungen dieser vier wiederholten Messungen und ihrer 95 %-Konfidenzintervalle (CI) wurden mithilfe der ICC-Funktion im R-Psych-Paket Version 2.1.9 berechnet [30]. Die Schätzungen basierten auf der absoluten Übereinstimmung der Messungen (k = 4), einem Zwei-Wege-Mixed-Effects-Modell [31]. Messungen mit ICC-Werten von weniger als 0,5 wurden als schlechte Zuverlässigkeit, Werte zwischen 0,5 und 0,7 als mäßige Zuverlässigkeit, Werte zwischen 0,75 und 0,9 als gute Zuverlässigkeit und Werte über 0,9 als ausgezeichnete Zuverlässigkeit definiert [31].

Um die diagnostische Genauigkeit des Koproantigen-ELISA mit der des FEC-, Plasma- und Eigelb-IgY-ELISA zu bewerten und zu vergleichen, wurde eine Receiver Operating Characteristic (ROC)-Analyse anhand von Proben durchgeführt, die einen Tag vor der Schlachtung entnommen wurden. Der paarweise Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) aus allen diagnostischen Tests wurde mit dem DeLong-Post-hoc-Test [32] durchgeführt, da die für die FEC-, Koproantigen- und IgY-Messungen verwendeten Stuhl-, Eigelb- und Blutproben angefertigt wurden derselbe Gastgeber. Die Testgenauigkeit der Tests wurde basierend auf dem Bereich des AUC-Werts interpretiert und wie folgt klassifiziert: geringe Genauigkeit (0,5 < AUC ≤ 0,7), mäßige Genauigkeit (0,7 < AUC ≤ 0,9) oder hohe Genauigkeit (AUC > 0,90) [33 ].

Die für den ROC-Vergleich verwendeten Datensätze umfassten APG-, EPG-, Plasma- und Eigelb-IgY-Werte experimentell infizierter Legehennen mit ihren entsprechenden Kontrollen, die während der Autopsie ermittelt wurden. Die Analyse wurde sowohl für Daten durchgeführt, die über WPI als auch innerhalb von WPI gepoolt wurden, um Unterschiede zwischen verschiedenen Zeitpunkten zu ermitteln, d. h. potenzielle zeitabhängige Unterschiede in der Gesamtleistung verschiedener Tests. In jedem Fall überstieg die Gesamtzahl der für die Analyse verwendeten Beobachtungen (n ≥ 28) die für eine ROC-Analyse erforderliche Mindeststichprobengröße. Die minimale Stichprobengröße wurde mit der Statistiksoftware MedCalc, Version 20.023 [34], mit einem voreingestellten Signifikanzniveau von 0,05, einer maximalen AUC von 0,99 und einem Gruppenverhältnis von 1 [33] berechnet. Alle Parameter des ROC- und DeLong-Vergleichstests wurden mit dem pROC-Open-Source-Paket für R berechnet [35].

Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden berechnet, um die gegenseitige Abhängigkeit zwischen infektionsbezogenen Parametern zu bestimmen, einschließlich Wurmlast, Wurmlänge, Wurmgewicht, FECs und Antigenkonzentration im Kot. Die Analyse basierte auf logarithmisch transformierten Daten [log(y+1)]. Um die Qualität jeder Diagnosemethode weiter zu bewerten, wurden Pearson-Korrelationen zwischen allen Variablen (z. B. Ascarid-spezifisches IgY in Plasma und Eigelb, APG und EPG mit Wurmlastparametern) innerhalb jedes WPI untersucht. Pearson-Korrelationsanalyse, deskriptive Statistik und Visualisierung von Daten wurden in der R-Umgebung für statistische Berechnungen durchgeführt [36].

Die festen Auswirkungen der Infektion (F(1.164) = 211,05, P < 0,001), des WPI (F(5.164) = 18,60, P < 0,001) und ihrer Wechselwirkungen (F(5.164) = 15,85, P < 0,001) auf die Antigenkonzentration ( APG) waren signifikant (Tabelle 2). Der von Tukey und Kramer angepasste paarweise Vergleich für den Effekt innerhalb des WPI ergab, dass sich die Antigenkonzentration zwischen Kontroll- und infizierten Tieren bei WPI 2 (t(164), = 0,66, P = 1,00) und WPI 4 (t(164), =) nicht signifikant unterschied −3,09, P = 0,094) (Abb. 2). APG stieg bei infizierten Legehennen um WPI 6 an (t(164), = −6,74, P < 0,001), und dann wurden bis zum Ende des Experiments bei WPI 18 signifikante Unterschiede (P < 0,001) zwischen infizierten und nicht infizierten Legehennen beobachtet Kontrollhühner unterschieden sich während des gesamten Experiments nicht signifikant (post hoc, Tukey-Kramer-angepasstes P > 0,05) in ihrer Antigenkonzentration über verschiedene WPI hinweg (Abb. 2), wohingegen es einen statistisch signifikanten Anstieg (P < 0,05) beim APG gab Werte infizierter Legehennen im gesamten WPI. APG bei den infizierten Legehennen war in den frühen Stadien der Infektion (zwischen WPI 2 und 4) signifikant unterschiedlich (t(164), = −4,62, P < 0,001), während es in späteren Phasen (z. B. zwischen WPI 6–18, [t(164), = −3,09, P = 0,094]) gab es keinen signifikanten Unterschied im APG infizierter Legehennen.

Konzentration von Ascarid-Antigenen im Kot (APG) von Kontroll- (schwarzer Kreis) und infizierten (blauer Kreis) Legehennen. Die Auswirkungen von Infektion, WPI und deren Wechselwirkung waren signifikant (P < 0,001). Statistische Analysen basieren auf logarithmisch transformierten Daten [log(y+1)], während die Visualisierung auf nicht transformierten Daten basiert. * Zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Kontroll- und infizierten Legehennen zu einem bestimmten Zeitpunkt an (Tukey-Kramer, P < 0,05). Jeder Punkt im Diagramm stellt eine einzelne Beobachtung dar. Die Anzahl der Beobachtungen (N = 716) bezieht sich auf 179 Hennen, die an vier aufeinanderfolgenden Tagen vor der Schlachtung beprobt wurden. Die vertikale Linie innerhalb der Boxplots zeigt den Stichprobenmedian, während das untere und obere Ende der Box das 25. bzw. 75. Quantil darstellen

Die ICC-Schätzungen der wiederholten APG-Messung sind in Abb. 3 dargestellt. Insgesamt ergab die Analyse eine hohe Wiederholbarkeitsschätzung (ICC = 0,91; 95 %-KI = 0,89–0,93) für die APG-Messung am selben Tier über vier wiederholte Messungen hinweg ein wpi. Es gab jedoch Schwankungen in der Wiederholbarkeit von APG über verschiedene Wochen hinweg. Die ICC-Schätzungen für die Messungen in WPI 2 waren niedrig (ICC = 0,08; 95 % KI = 0–0,47), aber APG-Messungen im gesamten verbleibenden WPI zeigten mittlere bis hohe Wiederholbarkeitsschätzungen (ICC 0,78–0,96). Die höchste Wiederholbarkeitsschätzung (ICC = 0,96; 95 %-KI = 0,94–0,98) wurde in Messungen aus WPI 6 aufgezeichnet.

Klasseninterner Korrelationskoeffizient (ICC) wiederholter Messungen der Antigenkonzentration pro Gramm Kot innerhalb jeder Woche nach der Infektion (wpi) und der Gesamt-ICC. Anzahl der obduzierten Hennen, n = 29 in jedem WPI, und in WPI 18, n = 34 (insgesamt N = 179 Hennen). Fehlerbalken stellen 95 %-Konfidenzintervalle dar

Es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in der gesamten Ascarid-spezifischen IgY-Konzentration sowohl im Plasma (F(1.164) = 82,85, P < 0,001) als auch im Eigelb (F(1.151) = 95,38, P < 0,001) zwischen infizierten und nicht infizierten Kontrollen gefunden (Tabelle 2). Die durchschnittliche IgY-Gesamtkonzentration über alle WPI hinweg war bei infizierten Legehennen höher als bei nicht infizierten Kontrollen. Allerdings waren die Unterschiede zeitabhängig. Die Unterschiede in der Antikörperantwort im Plasma zwischen den beiden Gruppen waren bei WPI 2 (t(164) = −6,35, P < 0,001), WPI 14 (t(164) = −5,05, P < 0,001) und WPI 18 signifikant ( t(164) = −5,37, P < 0,001) (Abb. 4a), während signifikante Unterschiede in den Eigelb-IgY-Konzentrationen bei WPI 4 (t(151) = −5,78, P < 0,001), WPI 14 (t( 151) = −4,67, P = 0,0004) und wpi 18 (t(151) = −6,29, P < 0,001) (Abb. 4b).

Ascarid-spezifische IgY-Konzentrationen im Plasma und im Eigelb von Kontroll- (schwarzer Kreis) und ascaridinfizierten Legehennen (blauer Kreis). Die Auswirkungen der Infektion und der Interaktion mit WPI waren signifikant (P < 0,001). Statistische Analysen basieren auf logarithmisch transformierten Daten [log(y+1)], während die Visualisierung auf nicht transformierten Daten basiert (n = 179 Hennen). * Zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Kontroll- und infizierten Legehennen zu einem bestimmten Zeitpunkt an (Tukey-Kramer, P < 0,05). Jeder Punkt im Boxplot stellt eine einzelne Beobachtung dar. Die vertikale Linie innerhalb der Boxplots zeigt den Stichprobenmedian, während das untere und obere Ende der Box das 25. bzw. 75. Quantil darstellen

Über eine detaillierte Darstellung der Wurmlast in beiden Wirtsgenotypen wurde bereits früher berichtet [24]. Abbildung 5 bietet visuelle Darstellungen der Wurmlast der Hennen mit A. galli und H. gallinarum sowie der FEC, die sich aus beiden Nematoden ergibt. Die Anzahl der Würmer war bei WPI 2 sowohl für A. galli (Abb. 5a) als auch für H. gallinarum (Abb. 5b) am höchsten. Die Anzahl der A. galli-Würmer nahm im Verlauf des Versuchszeitraums mit der Zeit ab, so dass die geringste Anzahl an Würmern bei WPI 18 gefunden wurde, wohingegen die niedrigste Anzahl von H. gallinarum bei WPI 10 gefunden wurde. Die Anzahl von H. gallinarum stieg von WPI an 14 bis WPI 18 aufgrund von Reinfektionen. EPG wurde erst in WPI 4 quantifiziert (Abb. 5c). Der durchschnittliche EPG stieg zwischen WPI 4 und WPI 6 und blieb dann bis WPI 14 relativ konstant, während der höchste durchschnittliche EPG beim letzten WPI beobachtet wurde. Während des gesamten Versuchszeitraums waren im Kot der Kontrolllegehennen keine Wurmeier vorhanden.

Wurmlast von Legehennen, die experimentell sowohl mit Ascaridia galli (a) als auch mit Heterakis gallinarum (b) infiziert wurden, und die Anzahl der Eier pro Gramm Kot (EPG) (c) über verschiedene Wochen nach der Infektion (n = 108). Bei den Zahlen handelt es sich um LS-Mittelwerte mit ihren Standardfehlern. Der EPG wurde durch wpi 4 bestimmt. Somit betrug die Anzahl der Stuhlproben für EPG n = 90

Die ROC-Analyse wurde durchgeführt, um die diagnostische Genauigkeit des Koproantigen-ELISA im Vergleich zu FEC, Eigelb und Plasma-IgY-ELISA zu untersuchen. Dabei wurden alle während des Experiments in jedem WPI durchgeführten Messungen verwendet. Die Ergebnisse der ROC-Analyse sind in Abb. 6 zusammengefasst und detaillierte Ergebnisse mit spezifischen Testleistungsparametern (z. B. AUC, Sensitivität, Spezifität) sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S1 dargestellt. Die Gesamtgenauigkeit des Koproantigen-ELISA war mit AUC = 0,93 hoch. Mit Ausnahme von WPI 2 und 4 wurde für diese Methode in allen WPI eine hohe Genauigkeit (AUC > 0,90) bestätigt. Die diagnostische Testgenauigkeit war bei WPI 18 (AUC = 1,00) am höchsten. Ebenso nahmen die Spezifität und Empfindlichkeit des Tests mit der Zeit zu; Laut WPI 4 ergab der Assay eine Spezifität von 100 %, jedoch mit einer geringen Sensitivität von 39 %. Um die Genauigkeit der Coproantigen-ELISA-Methode (d. h. APG) mit der Anzahl der fäkalen Eier (d. h. EPG) und dem Plasma- und Eigelb-IgY-ELISA vollständig zu vergleichen, wurden die verfügbaren Daten für den EPG- und IgY-Assay verwendet. Die Gesamt-AUC für FEC betrug 0,91, während der Plasma- und Eigelb-IgY-Assay eine Gesamtgenauigkeit von AUC = 0,83 bzw. 0,88 ergab (Abb. 5a). Der DeLong-Test zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Koproantigen-ELISA und FEC (Z = 0,674, P = 0,501) und Eigelb-IgY-ELISA (Z = 1,645, P = 0,100), wohingegen die Gesamtgenauigkeit des Plasma-IgY-Tests signifikant war (Z = 2,336). , P = 0,019) niedriger. Sowohl FEC als auch Coproantigen-ELISA hatten eine Spezifität von 100 %, während die Spezifität beim Plasma-IgY-Assay (72,9 %) und beim Eigelb-IgY-Assay (80 %) geringer war. FEC zeigte mit 82,2 % die höchste Sensitivität, gefolgt von Eigelb-IgY mit einer Sensitivität von 80 %, während sowohl Coproantigen- als auch Plasma-IgY-ELISA eine Sensitivität von 76,7 % aufwiesen.

Gesamte (a) und zeitpunktspezifische (b) diagnostische Genauigkeit des Coproantigen-ELISA im Vergleich mit Plasma- und Eigelb-IgY-ELISA und fäkalen Eizahlen bei Hühnern, die mit Ascaridia galli und Heterakis gallinarum infiziert sind. Die diagonale Linie entspricht der Hälfte der maximalen Fläche unter der Kurve (AUC = 1,0). Der DeLong-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen der AUC jedes diagnostischen Tests zu bestimmen. Das Signifikanzniveau wurde auf P < 0,05 voreingestellt. AUC-Werte mit den gleichen hochgestellten Zeichen zeigten keinen signifikanten Unterschied. Je weiter die Position der ROC-Kurve von der diagonalen Linie entfernt ist, desto höher ist die gesamte Testgenauigkeitsanalyse. Eine Zusammenfassung der AUC-Werte mit ihren Konfidenzintervallen für alle Diagnosemethoden innerhalb jedes WPI ist in (b) dargestellt.

Wir untersuchten die linearen Beziehungen zwischen allen infektionsbezogenen Parametern mithilfe der Pearson-Korrelationsstatistik mit gepoolten Daten über alle Wochen (Abb. 7a) und innerhalb jedes WPI (Abb. 7b) bei jeder diagnostischen Messung. Die mit der Länge und dem Gewicht der Würmer verbundenen Parameter zeigten bei APG höhere positive Korrelationskoeffizienten als bei EPG und beiden IgY. Die durchschnittliche Gesamtlänge von A. galli zeigte eine signifikante positive Korrelation mit APG (r(105) = 0,69, P < 0,001) und EPG (r(87) = 0,65, P < 0,001). Im Fall von H. gallinarum zeigte die Gesamtlänge des Wurms signifikante positive Korrelationen mit APG (r(102) = 0,61, P < 0,001) und EPG (r(84) = 0,38, P = 0,030). Es wurde jedoch eine negative Korrelation zwischen Plasma-IgY und der Gesamtlänge von A. galli (r(105) = −0,31, P = 0,100) und H. gallinarum (r(102) = −0,40, P = 0,010) gefunden. Das Gewicht von A. galli zeigte eine signifikante Korrelation (r(105) = 0,71, P < 0,001) mit APG und EPG (r(87) = 0,68, P < 0,001).

Gesamtkorrelationen mit gepoolten Daten über WPI hinweg zwischen verschiedenen Variablen, die die Wurmlast und diagnostische Messungen darstellen (a), und Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen jeder Wurmlastvariablen und APG, EPG und IgY innerhalb jedes WPI (b) (n ≥ 29). Die Pearson-Korrelationskoeffizienten (r) werden in den Quadraten dargestellt. Signifikante (P < 0,05) Korrelationen werden mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.

Nur EPG zeigte eine hohe Korrelation mit der Gesamtzahl der Würmer sowohl von A. galli (r(87) = 0,44, P < 0,001) als auch von H. gallinarum (r(87) = 0,32, P = 0,110). Als wir jedoch die Korrelation mit der Anzahl der Würmer nach Reife untersuchten, gab es eine signifikante positive Korrelation zwischen APG und der Gesamtzahl erwachsener Würmer (r(105) = 0,6, P < 0,001 für A. galli und r(105) = 0,52, P < 0,001 für H. gallinarum) und eine negative Korrelation mit der Gesamtzahl der Larven (r(105) = −0,59, P < 0,001 für A. galli und r(105) = −0,44, P < 0,001 für H. gallinarum). EPG korrelierte negativ mit den A. galli-Larven (r(87) = −0,31, P = 0,160) und positiv mit reifen Würmern (r(87) = 0,69, P <0,001 mit A. galli und r(87) = 0,33, P = 0,070 mit H. gallinarum). Plasma-IgY zeigte eine positive Korrelation mit H. gallinarum-Larven (r(105) = 0,54, P < 0,001) und A. galli-Larven (r(105) = 0,25, P = 0,370), Eigelb-IgY jedoch nicht. Wir haben weiter untersucht, ob die Korrelationen zwischen Wurmlast und Infektions-Proxys zeitabhängig sind. Das Ergebnis in Abb. 7b zeigt, dass die höchste Korrelation bei unterschiedlichen WPI für jeden der vier Infektions-Proxys auftrat. Die Korrelationen waren bei WPI 2 für alle Methoden am niedrigsten. Im Allgemeinen zeigte EPG in den meisten WPI signifikante positive Korrelationen mit der Anzahl der Würmer und Größenmessungen (Abb. 7b; Panel-EPG).

In dieser Studie wurden das Ausscheidungsmuster und die Wiederholbarkeit des Ascarid-Antigens im Kot von Legehennen im Laufe der Zeit untersucht und die Leistung von vier verschiedenen Methoden zur Diagnose von Nematodeninfektionen bewertet, wobei der Schwerpunkt auf Veränderungen der Testleistung zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion lag. Zu den Methoden gehörten die Zählung fäkaler Eier von McMaster, der Koproantigen-ELISA sowie der Plasma-IgY- und Eigelb-IgY-ELISA. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass lösliche Wurmantigene relativ regelmäßig über den Kot von Legehennen ausgeschieden werden. Die Antigenkonzentrationen im Kot infizierter Hühner stiegen im Laufe der Zeit an, was darauf hindeutet, dass die Antigenkonzentration mit zunehmender Reife der Würmer zunimmt. Zeitabhängig kann eine erhöhte Antigenkonzentration auch ein Ausdruck einer höheren Wurmbelastung und einer erneuten Infektion sein.

Um zu bestätigen, ob APG bei derselben Henne im Laufe der Zeit konsistent gemessen werden kann, haben wir Wiederholbarkeitsschätzungen der Antigenausscheidung durchgeführt, indem wir die Antigenkonzentration aus Kotproben derselben einzelnen Hühner an vier aufeinanderfolgenden Tagen innerhalb eines bestimmten WPI gemessen haben. Die Wiederholbarkeit ist das Maß, das das Ausmaß widerspiegelt, in dem eine Reihe von Messungen zuverlässig reproduziert werden kann, indem sowohl die Korrelation als auch die absolute Übereinstimmung zwischen den erhaltenen Werten gemessen werden [37]. Die Gesamtwiederholbarkeit (ICC = 0,91) bestätigt ein beträchtliches Wiederholungsmuster bei der Ausscheidung von Antigenen im Stuhl. Ab WPI 4, als das Antigen zuverlässig quantifiziert werden konnte, war die Übereinstimmung zwischen den Messungen an den vier Probenahmetagen hoch, was darauf hindeutet, dass die Antigenausscheidung im Kot der infizierten Hühner durchgängig täglich erfolgte und am selben Tier zuverlässig messbar ist.

Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse auch einzigartige zeitabhängige Unterschiede in der Testleistung verschiedener Diagnosemethoden, was die Notwendigkeit einer spezifischen Auswahl von einem oder zwei Werkzeugen nahelegt, um aussagekräftigere Hinweise auf Nematodeninfektionen bei Hühnern zu erfassen. Die Anzahl der Eier im Kot wird häufig zur Beurteilung von A. galli- und H. gallinarum-Infektionen verwendet. Aufgrund von Herausforderungen wie der Variabilität der Wurmfruchtbarkeit, der tageszeitlichen Schwankung der Eierausscheidung und der ungleichmäßigen Verteilung der Eier im Kot [19, 38] wurden jedoch neue Methoden entwickelt untersucht worden. Dazu gehören die Messung wurmspezifischer Antikörper im Wirtsplasma und Eigelb [13, 20] und löslicher Wurmantigene im Wirtskot [21] sowie PCR-basierte Ansätze [39]. Ascarid-spezifisches Plasma-IgY unterschied sich bereits bei WPI 2 signifikant zwischen infizierten und nicht infizierten Hühnern, was mit allen relevanten früheren Studien zur Messung der Immunantwort auf Nematodeninfektionen bei Hühnern übereinstimmt [22, 40, 41, 42]. Wir schließen daraus, dass die Diagnose mit dem Antikörper-ELISA eine frühere Erkennung einer Infektion ermöglichen kann als die Eizellzählung im Stuhl oder der Koproantigen-ELISA. Heterakis gallinarum-Larven werden fast 9 Stunden nach der Aufnahme der Eizellen durch den Wirt in den Blinddarm transportiert, wo sich die Larven für kurze Zeit in das oberflächliche Epithel einnisten [43]. Ebenso weisen die Larven von A. galli eine gewebeassoziierte Phase auf [44]. Somit sind bei WPI 2 die Dünndarm- und Blinddarmwände des Wirts hauptsächlich von Larven besiedelt, und zu diesem Zeitpunkt sind fast keine erwachsenen Würmer vorhanden, aber bei WPI 4 nimmt die Antikörperreaktion – wie durch ELISA quantifiziert – ab, was mit der Anwesenheit zusammenfällt von heranreifenden Würmern im Lumen. Dies stützt die Annahme, dass die Larven, die die Darmwand infizierter Hühner durchdringen, eine stärkere humorale Reaktion hervorrufen als die erwachsenen Würmer, die in das Lumen eingewandert sind [41]. Daher könnte die Migration der Larven von den Darmwänden in das Lumen zu einer geringeren Antikörperproduktion in den folgenden Wochen geführt haben. Bei WPI 14, was auf das Vorhandensein der nächsten Larvengeneration aufgrund einer erneuten Infektion hinweist, war die Antikörperreaktion bei infizierten Hühnern jedoch erneut deutlich höher. Die Studie von Marcos-Atxutegi et al. [41] stellten fest, dass lösliches Antigen aus embryonierten Eiern eine höhere mittels ELISA gemessene Antikörperkonzentration stimuliert als das Antigen des erwachsenen Wurms. In ähnlicher Weise zeigten unsere Ergebnisse aus der Korrelation zwischen Plasma-IgY und Wurmstadien, dass Plasma-IgY einen stärkeren positiven Zusammenhang mit der Anzahl der Larven aufweist als bei erwachsenen Würmern. Dieses Ergebnis steht auch im Einklang mit einem früheren Bericht von Daş et al. [22]. Dieser Zusammenhang war bei H. gallinarum-Larven viel stärker als bei A. galli, wahrscheinlich aufgrund der höheren Reinfektion mit H. gallinarum als mit A. galli [24].

Da der Hühnerwirt kreuzreaktive Antikörper gegen die beiden eng verwandten Nematodenarten entwickelt [13], könnte eine höhere Reinfektion mit H. gallinarum als mit A. galli höhere Korrelationen zwischen Askariden-spezifischem IgY und der Anzahl der H. gallinarum-Larven erklären. Trotz der Untersuchung mehrerer Zeitpunkte hatte Plasma-IgY keinen signifikanten Zusammenhang mit der gesamten Wurmlast, wodurch es für die quantitative Diagnose einer Nematodeninfektion bei Hühnern weniger geeignet ist. Im Hinblick auf die qualitative diagnostische Beurteilung kann die Messung von Ascarid-spezifischem Plasma-IgY angesichts der in dieser Studie erzielten relativ hohen diagnostischen Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität jedoch wertvoll sein. Die Sensitivitätswerte lagen über alle WPI hinweg zwischen 66 und 88 %. Im Vergleich zu früheren Studien ist dieser Wert niedriger. Sharma et al. [20] berichteten über eine diagnostische Sensitivität von 96 % für Plasma-IgY beim Nachweis einer A. galli-Infektion bei Hühnern, was dem von Daş et al. berichteten Ergebnis ähnelte. [13], die ebenfalls eine Sensitivität von 94 % meldeten. Wie in dieser Studie gezeigt, beeinflusst der Zeitpunkt der Probenentnahme die diagnostische Leistung der verwendeten Methode. Hier wurde die diagnostische Leistung des Antikörper-ELISA kontinuierlich bei verschiedenen WPI bis zu WPI 18 bewertet, anders als in den oben genannten Studien, in denen die Bewertung nur bei 25 WPI bzw. 28 WPI erfolgte, und könnte für die Unterschiede in den Ergebnissen verantwortlich sein. Dennoch können Plasma-IgY-Messungen als zuverlässiges Instrument zur Früherkennung einer Nematodeninfektion bei Hühnern angesehen werden.

Im Gegensatz dazu zeigt die FEC, obwohl sie aufgrund der Zeit vor dem Patent nicht bis WPI 4 quantifizierbar ist [45, 46], einen konsistenten und erheblich stärkeren Zusammenhang mit der gesamten Wurmlast. Es ist keine Überraschung, dass FEC erst in WPI 4 bewertet werden konnte, da die Eizählung im Kot auf der Anwesenheit weiblicher Würmer mit Fortpflanzungsreife im Wirtsdarm beruht und es bis zu 5–8 Wochen dauert, bis die Larven ihre Reife erreichen und beginnen Das Abwerfen von Eiern hängt von mehreren Faktoren ab [45]. Es ist allgemein bekannt, dass die FEC die Infektionsintensität gut widerspiegelt, aber wie in dieser Studie gezeigt, unterscheidet sich der Zusammenhang je nach Messzeitpunkt. Bei WPI 4 zeigte FEC eine geringe Korrelation mit erwachsenen Würmern, wohingegen FEC ab WPI 6 eine mäßig hohe Korrelation mit erwachsenen und der gesamten Wurmlast aufwies (Abb. 7b). Feyera et al. [47] fanden einen ähnlichen Korrelationsbereich bei WPI 8 und 10. Da die Eier der beiden Nematodenarten nicht zuverlässig unterschieden werden können [29], wurden möglicherweise auch die aktuellen Korrelationen zwischen EPG und der Wurmlast jeder Art unterschätzt.

Die ROC-Analyse zeigte, dass der Koproantigen-ELISA in WPI 2 in dieser frühen Phase nicht genau zwischen infizierten und nicht infizierten Hühnern unterscheiden konnte. Ebenso gab es zu diesem Zeitpunkt keinen signifikanten Unterschied in der fäkalen Antigenkonzentration zwischen den beiden Gruppen. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass der Koproantigen-ELISA nicht empfindlich genug ist, um die möglicherweise geringe Konzentration der von kleinen Larven freigesetzten Antigene nachzuweisen. Von WPI 4 bis zum Ende des Experiments zeigte das Coproantigen jedoch eine diagnostische Sensitivität und Spezifität im Bereich von 61–100 % bzw. 90–100 %. Weitere Studien sind erforderlich, um zu bestätigen, ob das im Kot ausgeschiedene Wurmantigen von der Eiablage abhängt oder damit zusammenhängt. Eine solche Studie könnte Veränderungen der fäkalen Antigenkonzentration bei Vorhandensein oder Fehlen von Wurmeiern im Stuhl bewerten. Im Allgemeinen zeigte die ROC-Analyse eine höhere qualitative Leistung für den Coproantigen-ELISA als für IgY-ELISA und FEC, außer in WPI 2, wo der Plasma-IgY-ELISA empfindlicher war. Die Korrelation zwischen APG und der Gesamtbelastung durch H. gallinarum und A. galli war bei WPI 4 bzw. WPI 6 am höchsten. APG korrelierte am besten mit dem A. galli-Gewicht und nicht mit der Anzahl der A. galli-Würmer, was auf die Ausscheidung von mehr Antigenen aus den größeren Würmern schließen lässt; Für einen Vergleich stehen jedoch keine Daten zum Gewicht von H. gallinarum zur Verfügung. Basierend auf den verfügbaren Daten kann man davon ausgehen, dass die Antigenkonzentration im Stuhl eher die Größe der Würmer als die Anzahl der Würmer widerspiegelt.

Wir kommen zu dem Schluss, dass lösliche Wurmantigene regelmäßig über den Kot eines infizierten Wirts ausgeschieden werden und im Laufe der Zeit wiederholt an derselben Henne gemessen werden können. Im Vergleich zu anderen Methoden bietet der Koproantigen-ELISA die qualitativ beste Diagnosemethode. Der Plasma-IgY-Test hat sich als das zuverlässigste Instrument zur Frühdiagnose einer Nematodeninfektion erwiesen. Schließlich ist FEC in Bezug auf die Infektionsintensität überlegen und bleibt ein besserer Indikator für die Gesamtbelastung durch adulte Würmer, jedoch nur nach der Durchgängigkeit. Wir schlagen vor, dass die Kombination verschiedener Tools anstelle nur eines Tools eine bessere Darstellung von Infektionen aufgrund von Veränderungen im Entwicklungsstadium, der Wurmgröße und der Fruchtbarkeit im Laufe der Zeit ermöglichen würde. Dies legt die Notwendigkeit einer komplementären Nutzung verschiedener Instrumente für eine genauere Diagnose und Quantifizierung von Infektionen nahe.

Die in dieser Studie verwendeten Daten wurden in einem Open-Source-Datenrepository hinterlegt (DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7974367).

Antigen pro Gramm Kot

Fläche unter der Kurve

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Eier pro Gramm Kot

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Betriebseigenschaften des Empfängers

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Birgit Mielenz (FBN) und Birgit Sohnrey (Universität Göttingen) für ihre technische Unterstützung. Wir danken auch den technischen Mitarbeitern des Forschungsinstituts für Nutztierbiologie, Dummerstorf, für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Durchführung der Experimente.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Diese Arbeit ist ein Ergebnis des MONOGUTHEALTH-Projekts, das im Rahmen der Marie-Sklodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 955374 Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union erhalten hat. Das Infektionsexperiment wurde zuvor im Rahmen des Integhof-Projekts (Deutschland) durchgeführt ) gefördert aus Mitteln des Sondervermögens des Bundes bei der Landwirtschaftlichen Rentenbank (Förderkennzeichen 28RZ3-72.051).

Forschungsinstitut für Nutztierbiologie (FBN), Institut für Ernährungsphysiologie „Oskar Kellner“, Wilhelm-Stahl-Allee 2, 18196, Dummerstorf, Deutschland

Oyekunle John Oladosu, Manuel Stehr, Cornelia C. Metges & Gurbuz Stone

TECOmedical Group, Marie-Curie-Str. 1, 53359, Rheinbach, Deutschland

Mark Hennies

Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, Freie Universität Bozen, Universitätsplatz 5, 39100, Bozen, Italien

Matthias Gauly

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GD, CCM und MG haben die Studie konzipiert. MH und GD entwickelten das Koproantigen-ELISA-System. GD und MS lösten die experimentellen Infektionen aus und führten die Experimente mit Hühnern durch. OJO führte die statistische Analyse aller Daten durch. OJO und GD interpretierten die Daten. OJO hat den Originalentwurf des Manuskripts geschrieben. GD, CCM, MS, MG und MH überprüften den Manuskriptentwurf. GD, MG und CCM trugen zur Finanzierung bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Gürbüz Daş.

Das Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern erteilte die Genehmigung für den Versuch mit der Genehmigungsnummer AZ.: 7221.3-1-080/16. Der Umgang mit Tieren und die Versuchsabläufe folgten den Tierschutzvorschriften.

Unzutreffend.

Mark Hennies arbeitet in einem medizinischen Unternehmensnetzwerk (TECOmedical Group), das serologische Tests entwickelt und vertreibt. Die anderen Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Gewichts-Längen-Verhältnis männlicher (a) und weiblicher (b) A-Galli-Würmer. https://doi.org/10.5281/zenodo.7974367.

Qualitative Testleistungsparameter verschiedener Diagnosetests, abgeleitet aus der Receiver-Operator-Characteristics-Analyse (ROC).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Oladosu, OJ, Hennies, M., Stehr, M. et al. Muster und Wiederholbarkeit der Ascarid-spezifischen Antigen-Ausscheidung über Hühnerkot und die diagnostische Genauigkeit von Coproantigen-Messungen im Vergleich zu McMaster-Eierzahlen und Plasma- und Eigelb-Antikörpermessungen bei Legehennen. Parasites Vectors 16, 175 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05782-5

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Eingegangen: 01. Dezember 2022

Angenommen: 21. April 2023

Veröffentlicht: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05782-5

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