Hinweise auf einen horizontalen Gentransfer zwischen obligaten Blattknotensymbionten

The ISME Journal Band 10, Seiten 2092–2105 (2016)Zitieren Sie diesen Artikel

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Bakterien der Gattung Burkholderia gehen eine obligate Symbiose mit Pflanzenarten der Familien Rubiaceae und Primulaceae ein. Die in den Blättern untergebrachten Bakterien werden erblich übertragen und wurden noch nicht kultiviert. Wir haben die Genome von acht bakteriellen Blattknöllchensymbionten der Pflanzenfamilie Rubiaceae sequenziert und verglichen. Alle Genome weisen Merkmale auf, die mit einer Genomerosion vereinbar sind. Gene, die möglicherweise an der Biosynthese von Kirkamid, einem insektiziden C7N-Aminocyclitol, beteiligt sind, sind in den meisten Rubiaceae-Symbionten konserviert. Einige haben jedoch aufgrund der Erosion des Genoms den Kirkamid-Weg teilweise verloren und sind nicht in der Lage, die Verbindung zu synthetisieren. Die Kirkamid-Synthese ist daher nicht für den obligaten Charakter der Symbiose verantwortlich. Noch wichtiger ist, dass wir Hinweise auf Ereignisse des horizontalen Gentransfers (HGT) innerhalb der Gruppe finden, die sich auf Gene des Sekundärstoffwechsels auswirken. Dies weist darauf hin, dass in den frühen Stadien nach Wirtsrestriktion in Blattknotensymbiosen ein erheblicher Genfluss stattfinden kann. Wir schlagen vor, dass Wirtswechselereignisse und konjugative Plasmidtransfers diese HGTs gefördert haben könnten. Diese genomische Analyse von Blattknöllchensymbionten liefert erstmals neue Einblicke in die Genomentwicklung obligater Symbionten in ihren frühen Stadien der Assoziation mit Pflanzen.

Viele Mikroben können ein breites Spektrum nützlicher Wechselwirkungen mit Pflanzen aufbauen und tragen häufig zur Pflanzenernährung bei, beispielsweise zur Mineralgewinnung oder Stickstofffixierung, oder zur Pflanzenverteidigung durch die Synthese von Sekundärmetaboliten (Sachs und Simms, 2006). Die meisten dieser gegenseitigen Assoziationen sind fakultativ und wurden ausführlich untersucht (Philippot et al., 2013).

Im Gegensatz zu Tiersymbiosen, bei denen der Lebenszyklus des Symbionten häufig an den Wirt gebunden ist, sind Symbiosen mit vertikaler Übertragung bei höheren Pflanzen äußerst selten (Leigh, 2010). Es ist nur ein Fall bekannt, bei dem der bakterielle Symbiont vertikal übertragen wird und seine Anwesenheit für die Entwicklung des Wirts entscheidend ist. Diese einzigartige Symbiose entsteht zwischen Bakterien der Gattung Burkholderia und einigen Arten aus der Familie der Rubiaceae und Primulaceae.

Die Blattknötchensymbiose ist durch das Vorhandensein spezialisierter Strukturen in den Blättern gekennzeichnet, die Blattgallen oder Knötchen genannt werden (Miller, 1990). Diese Assoziation wurde in drei Rubiaceae-Gattungen beschrieben: Psychotria, Pavetta und Sericanthe (Lemaire et al., 2012). Knötchenartige Arten sind im tropischen und subtropischen Afrika endemisch, wobei die meisten knötchenartigen Psychotrien in Savannenlebensräumen vorkommen (Lachenaud, 2013). Morphologische und ontologische Studien zu Beginn des 20. Jahrhunderts zeigten das Vorhandensein extrazellulärer Bakterien in den Blattknötchen von Psychotria (Zimmermann, 1902; Von Faber, 1912). Darüber hinaus wurden diese Bakterien in allen Lebensstadien der Pflanze nachgewiesen, was auf einen geschlossenen symbiotischen Zyklus hindeutet, in dem die bakteriellen Symbionten durch Besiedlung der Samen erblich übertragen werden könnten. Bakterien sind für die Entwicklung der Pflanzen unerlässlich, da mit Hitze behandelte Samen zu aposymbiotischen Sämlingen keimen, die jedoch nicht reif werden und nach mehreren Monaten absterben (Miller, 1990; Van Oevelen et al., 2001). Umgekehrt haben Bakterien ihre Autonomie verloren und konnten noch nicht außerhalb des Wirts kultiviert werden. Nur kulturunabhängige molekulare Techniken ordneten die symbiotischen Bakterien der Gattung Burkholderia zu (Van Oevelen et al., 2002).

Das Genom von C andidatus Burkholderia kirkii, dem Blattknotensymbionten von Psychotria kirkii, hat neue Einblicke in die Genomentwicklung und die molekulare Natur dieser Symbiose geliefert (Carlier und Eberl, 2012). Das Genom von Ca. B. kirkii ist halb so groß wie andere eng verwandte, freilebende, pflanzenassoziierte Burkholderia und enthält eine große Menge an Pseudogenen und transponierbaren Elementen (Carlier und Eberl, 2012). Diese Eigenschaften kommen bei kürzlich entwickelten und vertikal übertragenen Symbionten häufig vor, wie dem obligaten Cyanobionten des Wasserfarns Azolla filiculoides (Ran et al., 2010), dem fakultativen Tsetsefliegen-Symbionten Sodalis glossinidius (Belda et al., 2010) oder der Blattlaus Cinara tujafilina co-obligater Symbiont Serratia symbiotica (Manzano-Marín und Latorre, 2014), was darauf hindeutet, dass Ca. B. kirkii hat vor Kurzem auf einen wirtsbeschränkten Lebensstil umgestellt. Der Prozess der Genomreduktion ist bei intrazellulären, obligaten Symbionten von Tieren gut dokumentiert, bei denen angenommen wird, dass Wirtsrestriktion und zelluläre Isolierung von Bakterien die Anhäufung schädlicher Mutationen verursachen, den Genverlust fördern und den horizontalen Gentransfer (HGT) verhindern (McCutcheon und Moran, 2012). ).

Die molekulare Natur der Blattknotensymbiose ist noch unbekannt. Frühere Spekulationen, einschließlich Hormonproduktion und Stickstofffixierung (Centifanto und Silver, 1964; Edwards und Lamotte, 1975), wurden mit den von Ca erhaltenen genomischen und proteomischen Informationen ausgeschlossen. B. kirkii (Carlier und Eberl, 2012; Carlier et al., 2013). Genomische und chemische Beweise deuten stattdessen auf eine pflanzenschützende Rolle der Blattknöllchenbakterien hin. Die Funktionsanalyse von Ca. Das Genom von B. kirkii zeigte das Vorhandensein eines biosynthetischen Genclusters für von 2-Epi-5-Epi-Valiolon abgeleitete Aminocyclitole aus der C7N-Aminocyclitol-Familie. Diese Gene, die sich auf dem 140-kb-Plasmid pKIR01 befinden, sind höchstwahrscheinlich an der Synthese von Kirkamid beteiligt, einem C7N-Aminocyclitol, das in den Blättern von knotigen P. kirkii vorkommt, aber in verkümmerten, aposymbiotischen Proben fehlt (Sieber et al., 2015). Interessanterweise wurden in anderen Burkholderia-Arten keine Homologen des mutmaßlichen C7N-Aminocyclitol-Biosyntheseclusters gefunden, was darauf hindeutet, dass diese Gene wahrscheinlich erst vor relativ kurzer Zeit von HGT erworben wurden (Carlier und Eberl, 2012). Reines Kirkamid ist zytotoxisch und insektizid und kann daher die Fitness der Pflanze durch den Schutz vor Pflanzenfressern steigern (Sieber et al., 2015).

Das Ziel dieser Studie bestand darin, (i) den Genomreduktionsprozess in Blattknoten-obligaten Symbionten zu charakterisieren und unsere Ergebnisse mit den klassischen Modellen zu vergleichen, die aus der Untersuchung vertikal übertragener, intrazellulärer tierischer Symbionten abgeleitet wurden, (ii) die Bedeutung des Sekundärstoffwechsels für die zu untersuchen Symbiose und (iii) genetische Determinanten identifizieren, die möglicherweise an der obligaten Natur der Symbiose beteiligt sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Produktion von C7N-Aminocyclitol-Sekundärmetaboliten bei den meisten Blattknotensymbionten erhalten bleibt, was die Bedeutung des Sekundärstoffwechsels für die Symbiose unterstreicht. Wir zeigen weiterhin, dass Kreuzinfektionsereignisse das Fehlen einer strikten Koevolution erklären können. Wir liefern auch Belege für aktuelle Ereignisse der HGT von C7N-Aminocyclitol-Biosynthesegenen. Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass bei Blattknotensymbionten Wirtsrestriktionen und frühe Stadien der Genomreduktion den Genfluss nicht ausschließen.

Für diese Studie wurden sieben Pflanzenarten der Familie der Rubiaceae ausgewählt und das Material wurde vom belgischen Nationalen Botanischen Garten bezogen (die Sammlungserwerbsnummern sind in Klammern angegeben, sofern verfügbar), mit Ausnahme von Psychotria punctata, für das das Material von einem authentifizierten aufbewahrten Exemplar bezogen wurde im Gewächshaus des Departements für Pflanzen- und Mikrobenbiologie der Universität Zürich. Die in dieser Studie verwendeten Arten sind: Psychotria humilis-Sammlungserwerbsnummer: BR2009135940, Psychotria pumila (BR2004143571), Psychotria verschuerenii (BR19750204), Psychotria umbellata (BR2007130262), Psychotria brachyanthoides (BR2009844596), Psychotria punctata und Pavetta schumanniana ( BR2000194257). Mit Kieselsäure getrocknete Blätter einzelner Exemplare wurden für alle Arten vom Botanischen Garten Meise bezogen, mit Ausnahme von P. punctata, für die frisches Material gewonnen wurde (siehe unten). Etwa 1000 Knötchen pro Probe, die symbiotische Bakterien enthielten, wurden mit einem Harris Uni-core 2,0-mm-Kernstanzwerkzeug (Whatman Inc., Kent, UK) präpariert und in 5 ml TNE-Puffer (100 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 200 mm NaCl, 10 mm Tris.Cl pH8) auf Eis für 1 Stunde. Die rehydrierten Knötchen wurden mit Mörser und Stößel zermahlen. Pflanzenreste wurden durch Filtrieren durch einen 10 μm Millipore-Nylonfilter entfernt. Der Durchfluss wurde gesammelt und die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 6000 U/min pelletiert. DNA mit hohem Molekulargewicht wurde nach Wilson (2001) extrahiert. Die Qualität der DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese und PCR-Amplifikation des bakteriellen ribosomalen 16S-RNA-Gens beurteilt. Der Grad der Pflanzen-DNA-Kontamination in genomischen DNA-Präparaten wurde durch semiquantitative PCR unter Verwendung von Primern bewertet, die auf dem P. kirkii-Chloroplasten-rbcL-Gen (5′-CCGGTACTGTAGTCGGGAAA und 5′-CCAAAGATCTCCGTCAGAGC) entwickelt wurden, und Standards, die aus bakterienfreier DNA bestanden, die aus nicht-bakterieller DNA hergestellt wurde. knotige Teile der untersuchten Pflanzen. Der Anteil der bakteriellen genomischen DNA in unseren Präparaten aus Knötchen lag durchweg über 80 % (Gew./Gew.).

Blattknötchen mit Ca. B. punctata wurden aus einem P. punctata-Exemplar gewonnen, das im Botanischen Garten der Universität Zürich aufbewahrt wird. Bakterien wurden durch Dichtegradientenzentrifugation gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll vom Pflanzenmaterial getrennt (Carlier und Eberl, 2012). Genomische DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt.

Genomische DNA wurde am Functional Genomics Center of Zurich (FGCZ) sequenziert. Paired-End-250-bp-Bibliotheken wurden mit dem Nextera XT-Kit (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) erstellt und mit der Illumina Miseq-Sequenzierungsplattform sequenziert. Die Reads wurden mithilfe der Adapter-Trimmfunktion der Scythe-Software (https://github.com/vsbuffalo/scythe) für die Assemblierung vorbereitet und Sequenzierungs-Reads mit einem Phred-Score unter 30 wurden mithilfe des FastQC-Pakets (http://www. bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc). Die durchschnittliche Abdeckung für die sieben sequenzierten Proben betrug 50 × und die Leselänge betrug im Durchschnitt 230 bp. Um Sequenzierungsablesungen bakteriellen Ursprungs aus Proben zusammenzustellen, die kontaminierende Pflanzengenome enthalten, wurde ein Binning-Ansatz verwendet (Albertsen et al., 2013). Die vorläufige Zusammenstellung der Lesevorgänge erfolgte mit CLC Genomics Workbench v7.0 (http://www.clcbio.com) (CLC Bio-Qiagen, Aarhus, Dänemark) mit niedrigen Stringenzparametern. Der Gehalt an Guanin und Cytosin (GC) und die durchschnittliche Leseabdeckung der resultierenden Contigs wurden mithilfe des in R (Wickham, 2009) implementierten ggplot-Pakets aufgezeichnet (ergänzende Abbildung S1). Da die Genome der Pflanzen um mehrere Größenordnungen größer sind als die der Symbionten und einen niedrigen GC-Prozentsatz aufweisen, wurden Cluster von Contigs mit hoher Abdeckung (ca. über 70 ×) und hohem GC-Prozentsatz als bakterielle Contigs ausgewählt und der Rest ebenfalls gelten als Pflanzenschadstoffe. Um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, wurden alle Contigs mithilfe der Blast-Software anhand der NT-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) durchsucht (Altschul et al., 1990). Sequenzierungsablesungen mit einem zugeordneten Partnerpaar wurden mithilfe von SAMtools (Li et al., 2009) und Ad-hoc-Python-Skripten aus den Contigs extrahiert, die den Bakteriengenomen zugeordnet waren. Extrahierte Lesevorgänge wurden für die De-novo-Assemblierung mit dem SPAdes v3.0-Assembler mit k-mer-Längen von 55, 77 und 100 verwendet (Bankevich et al., 2012). Das QUAST-Programm wurde verwendet, um die zusammenfassenden Statistiken der Versammlung zu erstellen (N50, maximale Contig-Länge, GC%) (Gurevich et al., 2013). Die Gesamtlänge der Contigs wurde zur Schätzung der Genomgröße verwendet.

Die teilweise Zusammenstellung des Chloroplastengenoms erfolgte durch Kartieren der Sequenzierungsablesungen mit der CLC Genomics Workbench v7.0 (http://www.clcbio.com; CLC Bio-Qiagen) auf das Chloroplastengenom von P. kirkii, das als Teil des Ca erhalten wurde. B. kirkii-Sequenzierungsprojekt (Carlier und Eberl, 2012).

Genomische DNA von Ca. B. punctata wurde für die Vorbereitung und Sequenzierung von Einzelmolekül-Echtzeitbibliotheken (SMRT) unter Verwendung der P2-Chemie auf dem RSII-Instrument von Pacific Biosciences (PacBio) am FGCZ verwendet. Eine 0,5-kb-Insert-Bibliothek wurde unter Verwendung von 13 SMRT-Zellen sequenziert, um hochwertige zirkuläre Konsenssequenz-Reads zu generieren. Eine zweite 6-kb-Insert-Bibliothek wurde unter Verwendung von vier SMRT-Zellen sequenziert, um kontinuierliche lange Lesevorgänge zu generieren. Rohe Lesedaten wurden mithilfe der PacBio SMRTportal v1.4-Pipeline gefiltert und analysiert. Die qualitativ hochwertigen Long Reads wurden generiert, indem die zirkulären Konsenssequenz-Reads mithilfe des PacBiotoCA-Dienstprogramms des Celera-Assembler-Pakets in kontinuierliche Long Reads-Reads abgebildet wurden (Koren et al., 2013). Die Zusammenstellung der korrigierten Lesevorgänge erfolgte mit der Software MIRA v3.4 (Chevreux et al., 1999). 49 Contigs mit einer durchschnittlichen Abdeckung von 42 × wurden in GAP5 erfasst und bearbeitet (Bonfield und Whitwham, 2010).

Offene Leserahmen wurden mit der Prodigal-Software (Hyatt et al., 2010), Transfer-RNA-Gene mit tRNAscan (Schattner et al., 2005) und ribosomale RNA-Gene mit RNAmmer (Lagesen et al., 2007) erkannt. Kodierende DNA-Sequenzen wurden mit dem Online-Annotationsdienst „Rapid Annotation using Subsystem Technology“ (RAST) annotiert, und Stoffwechselinformationen wurden aus dem in RAST implementierten Annotationstool „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes“ abgerufen (Aziz et al., 2008). Informationen zur Genontologie wurden mit dem Programm Blast2GO gesammelt (Conesa et al., 2005) und die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung wurde mit InterProScan durchgeführt (Zdobnov und Apweiler, 2001). Sequenzabschnitte über 1 kb ohne Annotationen, möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Codon-Nutzung oder GC-Bias, wurden manuell mit Artemis und der NCBI Blast-Software-Suite annotiert (Altschul et al., 1990; Rutherford et al., 2000). Funktionelle Gene und Pseudogene wurden gemäß der von Carlier et al., 2013, entwickelten Pipeline vorhergesagt. Darüber hinaus wurden Pseudogene durch Homologiesuche intergener Regionen mithilfe des NCBI-Blastx-Programms anhand einer benutzerdefinierten Datenbank von Proteinsequenzen annotiert, die aus Burkholderia-Genomen vorhergesagt wurden. Es wurden nur Treffer mit mehr als 50 % Identität und einem E-Wert <10−6 berücksichtigt. Trefferregionen wurden mithilfe des tfasty-Programms der FASTA-Software-Suite v3.6 mit der am besten bewerteten Proteinsequenz des Subjekts abgeglichen, um die Grenzen der Pseudogene zu ermitteln (Pearson, 2000). Die Zuordnung von Pseudogenen zu COG-Funktionskategorien erfolgte anhand der Sequenz des besten Blast-Hit-Proteins (siehe unten).

Wiederholte Sequenzen wurden mit dem Programm RepeatScout v1.0.5 erkannt (Price et al., 2005). Um die Diversität der Insertionssequenzen (IS) zu charakterisieren, wurde das gesamte Genom mit ISsaga analysiert (Varani et al., 2011). Um die Annotation zu verfeinern, wurden Wiederholungen mit mehr als 500 bp mithilfe des NCBI-Blastx-Programms in der ISfinder-Datenbank durchsucht. Die annotierten Genome wurden bei der Genbank unter den Zugangsnummern LFMX00000000, LFLF00000000, LFKV00000000, LFJJ00000000, LFJI00000000, LELG00000000 und LFJH00000000 hinterlegt.

Um die phylogenetischen Beziehungen zwischen Burkholderia-Blattknotensymbionten und anderen pflanzenassoziierten Burkholderia-Arten aufzudecken, haben wir einen phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit einer verketteten Ausrichtung von 534 Einzelkopie-Orthologen rekonstruiert. Aminosäuresequenzen wurden mit MUSCLE abgeglichen (Edgar, 2004) und mit T-Coffee in Nukleotide zurückübersetzt (Notredame et al., 2000). Positionen des Alignments mit Lücken in mehr als 50 % der Sequenzen wurden mit TrimAl entfernt (Capella-Gutiérrez et al., 2009). Die Maximum-Likelihood-Rekonstruktion wurde unter Verwendung von RAxML v8.0 (Stamatakis, 2014) mit dem GTRGAMMA-Nukleotidsubstitutionsmodell und 1000 schnellen Bootstrap-Analysen durchgeführt. Eins-zu-eins-Ortholog-Gene wurden durch Vergleich einer Genomdatenbank mit sechs Burkholderia-Arten mit einer vorteilhaften Assoziation mit Pflanzen (B. phymatum STM815, B. phytofirmans PsJN, B. xenovorans LB400, B. sp. CCGE1001, B. sp. CCGE1002) erhalten , B. sp. CCGE1003), drei häufig im Boden vorkommende (B. sp. YI23, B. sp. SJ98, B. glathei), ein Bohnenwanzensymbiont (B. sp. RPE64) und acht Burkholderia-Blattknotensymbionten (Ca . B. kirkii, Ca. B. punctata, Ca. B. humilis, Ca. B. umbellata, Ca. B. schumanniana, Ca. B. verschuerenii, Ca. B. brachyanthoides, Ca. B. pumila). Um den Baum zu bewurzeln, verwendeten wir zwei Arten (B. cenocepacia J2315 und B. ambifaria AMMD), die zum Burkholderia cepacia-Komplex gehören (Suárez-Moreno et al., 2012).

Der Maximum-Likelihood-Baum für die sieben Pflanzenarten wurde aus einem verketteten Alignment eines konservierten 30-kb-Segments der Chloroplasten-Genomsequenz erhalten. Die konservierte Region wurde in den Genomen mithilfe der Mauve-Software identifiziert (Darling et al., 2010) und mithilfe des MUSCLE-Algorithmus mit Standardeinstellungen abgeglichen. Die Chloroplastensequenz von Pa. schumanniana wurde als Außengruppe zur Wurzelbildung des Baumes verwendet (Denoeud et al., 2014).

Um die Evolutionsraten von Blattknotensymbionten zu bestimmen, wurden die Raten synonymer (dS) und nicht-synonymer (dN) Substitutionen für die Genfamilien geschätzt, wobei in jeder der acht Arten genau ein Ortholog vorhanden war. Proteinsequenzen für jeden Ortholog-Cluster wurden mit MUSCLE (Edgar, 2004) abgeglichen und anschließende Nukleotid-Codon-Alignments wurden mit Pal2nal-Perl-Skript generiert und getrimmt (Suyama et al., 2006).

Paarweise dN/dS-Werte wurden mit dem Codeml-Modul des PAML v4.4-Pakets unter Verwendung der folgenden Einstellungen (Modell=−2 und Codonfrequenz=2) geschätzt (Yang, 2007). Gene mit dS-Werten nahe der Sättigung (dS>2) wurden von den Analysen ausgeschlossen.

Um die Sensitivität zu erhöhen, analysierten wir Websites unter positiver Auswahl mit einem in Codeml implementierten Site-Modelltest (Yang und dos Reis, 2011). Wir haben das Nullmodell M7 (mit Beta-Verteilung für ω) dem Alternativmodell M8 (Beta-Verteilung für ω und eine zusätzliche Klasse von Standorten unter positiver Selektion mit ω>1) gegenübergestellt. Der Likelihood-Ratio-Test wurde für jedes Modell durchgeführt und die Ergebnisse mit einer χ2-Verteilung mit zwei Freiheitsgraden und einem Alpha-Wert von 0,01 verglichen.

Jedem offenen Leserahmen wurden Funktionskategorien von Clustern orthologer Gruppen (COG) zugewiesen. Dies wurde mit einem umgekehrten positionsspezifischen Blast (RPS-BLAST) gegen die NCBI-Datenbank für konservierte Domänen (E-Wert-Grenzwert von 1 × 10−3) erreicht. Zu jeder COG-Kategorie gehörende Gene wurden gezählt und die Verteilungen mithilfe eines Pearson-χ2-Testlaufs mit dem R-Softwarepaket verglichen (R Development Core Team., 2011).

Um die Genome von Blattknotensymbionten zu vergleichen, wurden vorhergesagte Proteinsequenzen mithilfe der OrthoMCL v1.4-Software mit reziprokem Blastp (E-Wert-Cutoff von 1e10−6 und 50 % Identität und 50 % Übereinstimmungslängen-Cutoff) geclustert (Li et al. , 2003). Kern- und akzessorische Gene von Blattknotensymbionten wurden auf der Grundlage der Genfamilienclusterung wie zuvor beschrieben definiert (Carlier und Eberl, 2012).

Für jede Pflanzenprobe wurden ganze Blätter entnommen und auf Kieselgel getrocknet. Die Proben wurden zu einem Pulver gemahlen, 24 Stunden lang in Methanol mazeriert, filtriert und getrocknet. Ein Teil des Extrakts wurde in Wasser (500 μl) gelöst, filtriert, in ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Fläschchen überführt und durch Lyophilisierung getrocknet. MSTFA (N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde zugegeben, die Mischung 30 Minuten bei 70 °C gerührt, Pyridin (trocken, gleiches Volumen wie MSTFA) wurde zugegeben , und die Reaktion wurde filtriert. Proben von 5 μl wurden auf einem Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Gaschromatographen der TRACE 1300-Serie analysiert, der mit einem Thermo Scientific ISQ Series Single Quadrupol-Massenspektrometer ausgestattet war, unter Verwendung einer HP-Ultra-1-Säule (Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA), 25 m × 0,200 mm, 0,35 μm). Die GC-MS-Läufe wurden mit einer Anfangstemperatur von 40 °C (1 Minute lang gehalten), einem linearen Anstieg von 7 °C min−1 und einer Endtemperatur von 330 °C (10 Minuten lang gehalten) durchgeführt. Als Kontrolle wurden auch Derivatisierungen und GC-MS-Analysen mit synthetischem Kirkamid durchgeführt und die Daten als Analysestandard verwendet (siehe ergänzende Informationsmethoden).

Eine Lösung von Maleinsäure als interner Standard (Sigma Aldrich, TraceCERT) wurde mit einer Konzentration von 0,52 μmol ml−1 in D2O (99,9 % deuteriert) hergestellt und die NMR-Experimente wurden auf einem Bruker Avance III NMR-Spektrometer durchgeführt, das mit 500 MHz Protonen betrieben wurde Frequenz.

Die für Maleinsäure ausgewählten Protonen zeigten eine chemische Verschiebung zwischen 6,30 und 6,20 ppm, für Streptolglucosid zwischen 5,966 und 5,941 ppm und für Kirkamid zwischen 5,887 und 5,874 ppm (Ergänzende Abbildung S2A). Für diese Protonen wurden die Verzögerungszeiten bestimmt und Werte von 7,5 s für Maleinsäure, 1,7 s für Streptolglucosid und 2,2 s für Kirkamid ermittelt. Die quantitativen 1H-NMR-Messungen erfolgten mit einer Relaxationsverzögerung (D1) von 40 s, einer Anzahl von Scans (ns) von 128 oder 256, einer spektralen Breite (sw) von 1,2 ppm und einem Sender-Offset (O1) von 6 ppm . Der Wasserpeak bei 4,79 ppm wurde als Referenz für die Kalibrierung des Maleinsäurepeaks basierend auf einem zweiten 1H-NMR-Spektrum verwendet, das für jede Messung aufgezeichnet wurde. Die Konzentrationen von Streptolglucosid und Kirkamid wurden durch Vergleich ihrer Peakintegration mit der für Maleinsäure gemessenen berechnet. Zur Bestimmung von Kirkamid im P. kirkii-Blätterextrakt wurde ein Mischversuch durch Dotieren mit 40 μg synthetischem Kirkamid durchgeführt. Die wie für die GC-MS-Messung beschriebenen Blattextrakte wurden mit einer Analysenwaage (Mettler-Toledo XA105DU) gewogen.

Die Zusammenstellung der Paired-End-Reads von Illumina Miseq führte zu mehreren Hundert Gerüsten für die meisten sequenzierten Genome (mit Ausnahme von C a. B. punctata, deren Genom mithilfe von Long-Read-Daten zusammengestellt wurde) und einer durchschnittlichen Abdeckung von über 50 × (detaillierte Informationen in Tabelle 1). Die Fragmentierung der Baugruppen wurde hauptsächlich durch sich wiederholende Sequenzen verursacht, die von mobilen Elementen abgeleitet waren.

Die Analyse der Contigs zeigte das Vorhandensein einer einzigen Art symbiotischer Bakterien pro Pflanzenprobe. Die Genomgrößen der in dieser Studie sequenzierten Blattknotensymbionten variierten zwischen 2,4 MB für Ca. B. schumanniana und 6,1 MB für Ca. B. verschuerenii (Tabelle 1). Die Genome zeigten auch unterschiedliche Kodierungskapazitäten von 41,7 % für Ca. B. pumila auf 67,3 % für Ca. B. verschuerenii (Abbildung 1).

Genomgrößen und kodierende Anteile des Blattknotens Burkholderia. Schätzungen der Genomgröße für alle Blattknöllchenbakterien sind grau dargestellt. Der Anteil des kodierenden Genoms und die entsprechenden Prozentwerte sind in Schwarz dargestellt.

Der Übergang vom freien Leben zur obligaten Symbiose führt häufig zu deutlichen Veränderungen in der Genomarchitektur (Moya et al., 2008; Toft und Andersson, 2010; McCutcheon und Moran, 2012). Abgesehen von einer reduzierten Genomgröße und Kodierungskapazität haben Blattknotensymbionten andere Merkmale mit obligaten Symbionten in den frühen Stadien der Symbiose gemeinsam, wie etwa die Anhäufung von Pseudogenen und transponierbaren Elementen (Toh et al., 2006; Burke und Moran, 2011; Oakeson). et al., 2014). Etwa 60 % der DNA-kodierenden Regionen sind durch Frameshift oder Nullmutationen unterbrochen und es wurde keine signifikante Tendenz zum Verlust einer bestimmten funktionellen Genkategorie beobachtet (Abbildung 2). Dies weist darauf hin, dass die genetische Drift die wichtigste evolutionäre Kraft ist, die die Erosion von Genfunktionen in den Genomen der Blattknotensymbionten vorantreibt, ähnlich wie es bei anderen obligaten Symbionten beobachtet wurde (Mira und Moran, 2002).

Verteilung der in allen Blattknotensymbionten konservierten Gene in funktionellen Kategorien von COGs. Für jede COG-Kategorie wurde die Anzahl der funktionellen Gene (graue Balken) und die Gesamtzahl der Gene einschließlich Pseudogene (schwarze Balken) verglichen. (J)=Translation, ribosomale Struktur und Biogenese; (K)=Transkription; (L)=DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur; (D)=Zellteilung und Chromosomenaufteilung; (O)=posttranslationale Modifikation, Proteinumsatz, Chaperone; (M)=Biogenese der Zellhülle, äußere Membran; (N)=Zellmotilität und -sekretion/intrazellulärer Transport und Sekretion; (P)=anorganischer Ionentransport und Metabolismus; (T)=Signaltransduktionsmechanismen; (C)=Energieerzeugung und -umwandlung; (G)=Kohlenhydrattransport und -stoffwechsel; (E)=Aminosäuretransport und -stoffwechsel; (F)=Nukleotidtransport und -stoffwechsel; (H)=Coenzym-Stoffwechsel; (I)=Fettstoffwechsel; (Q)=Biosynthese, Transport und Katabolismus von Sekundärmetaboliten; (R)=nur allgemeine Funktionsvorhersage; (S)=Funktion unbekannt.

Transponierbare Elemente sind in allen Blattknoten-Symbionten reichlich vorhanden und könnten eine wichtige Rolle in den ersten Schritten der Genomreduktion spielen. Mindestens neun verschiedene IS-Familien waren in Blattknotensymbionten vertreten. Die Verteilung dieser Familien ist uneinheitlich und den meisten identifizierten mobilen Elementen fehlt eine funktionelle Kopie im Genom (Ergänzungstabelle S1). Wir konnten in mehreren Genomen nur vollständige Kopien verfolgen, die den Familien IS3, IS4, IS5, IS66 und IS200 entsprechen.

Die Variabilität in der Kopienzahl und der Lokalisierung von IS-Elementen aus derselben Familie über Blattknoten-Symbiontengenome hinweg legt nahe, dass: (i) die Proliferation einer IS-Familie in einem bestimmten Genom zufällig ausgelöst wird und (ii) der kürzliche Übergang zu einem wirtsspezifischen Lebensstil stattgefunden hat könnte die rasche Verbreitung von IS-Elementen stimuliert haben. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit dem vorgeschlagenen neutralen Punktmodell für die Verbreitung von IS-Elementen (Iranzo et al., 2014). Dieses Modell sagt eine Instabilität der IS-Kopienzahl nach einer Änderung der Umgebung voraus, beispielsweise nach der Etablierung eines wirtsspezifischen Lebensstils. Die Tatsache, dass wir viele inaktivierte oder verkürzte IS in den Blattknoten-Symbiontengenomen finden, könnte entweder auf eine insgesamt starke Deletionsverzerrung oder auf eine Rückkehr zu einem stabileren Zustand hinweisen, in dem die Vermehrung und Eliminierung aktiver IS-Kopien wieder ins Gleichgewicht kommen.

Alle Blattknoten-Symbiontengenome weisen eine extrem niedrige Syntenie auf, was mit einem umfassenden Genom-Shuffling durch transponierbare Elemente vereinbar ist. Wir verglichen das Genom von Ca. B. punctata, die wir in großen Gruppen sammeln konnten, mit dem des verwandten Stinkbug-Symbionten Burkholderia sp. RPE64. Das Alignment zeigt überwiegend kleine syntenische Blöcke mit mehr als 100 kb. Im Gegensatz dazu ist das weiter entfernt verwandte, frei lebende, im Boden isolierte B. sp. YI23 zeigt eine relativ hohe Syntenie mit Burkholderia symbiont sp. RPE64 mit Abschnitten syntenischer DNA, die sich über ganze Replikons erstrecken (Ergänzende Abbildung S3). Viele Umlagerungen werden innerhalb von Gerüsten beobachtet und in vielen Fällen werden syntenische Blöcke von intakten oder inaktivierten Transposasen flankiert. Dies legt nahe, dass mobile Elemente, möglicherweise in Kombination mit homologer Rekombination, die massiven DNA-Umlagerungen erleichterten, die bei den Blattknöllchengenomen beobachtet wurden.

Genomumordnung, IS-Proliferation und eine große Anzahl von Pseudogenen weisen darauf hin, dass die genetische Drift eine wichtige treibende Kraft bei der Gestaltung der Genome der Blattknöllchensymbionten ist. Bei anderen obligaten und vertikal übertragenen Symbionten ist die genetische Drift bekanntermaßen die wichtigste evolutionäre Kraft, die die Genomarchitektur prägt, während die reinigende Selektion weniger effektiv ist (Kuo et al., 2009). Dies führt häufig zur Anhäufung schädlicher Mutationen (ein Prozess, der als Muller-Ratsche bekannt ist) (Muller, 1964; Felsenstein und Yokoyama, 1976; Moran, 1996; McCutcheon und Moran, 2012). Da die fortschreitende Erosion des Genoms häufig zu hohen Raten von nicht-synonymen (dN) zu synonymen (dS) Substitutionen im gesamten Genom führt, haben wir die dN/dS-Substitutionsraten für die 798 echten Orthologen in allen Blattknoten-Symbiontengenomen berechnet. Das durchschnittliche dN/dS-Verhältnis betrug 0,07 (Abbildung 3), wohingegen frei lebende Bakterien oder fakultative Symbionten ein durchschnittliches dN/dS-Verhältnis zwischen 0,02 und 0,06 aufweisen (Kuo et al., 2009).

Synonym- (dS) und nicht-synonyme (dN) Substitutionsraten, abgeleitet aus paarweisen Vergleichen der 798 echten orthologen Gene (graue Punkte) in allen Blattknoten-Symbiontengenomen. Die Boxplots in den angrenzenden Achsen stellen die Verteilung der dS- und dN-Werte und der Ausreißer dar.

Unsere Beobachtungen stimmen bisher mit dem überein, was für andere obligate Symbionten, einschließlich Endosymbionten von Insekten, beschrieben wurde (McCutcheon und Moran, 2012). In diesen Fällen führt eine entspannte Selektion normalerweise zu einer Anreicherung des Genoms mit Adenin und Thymin (A+T) und einem geringeren GC-Prozentsatz bei obligaten Symbionten im Vergleich zu frei lebenden Verwandten (McCutcheon und Moran, 2012). Im Gegensatz dazu liegt der durchschnittliche GC-Prozentsatz des Genoms von Blattknöllchen-Symbionten (60–63 %) im Bereich der verwandten frei lebenden Burkholderia (62–65 %). Ein Grund für den hohen GC-Prozentsatz der Genome könnte auf das relativ junge Alter der Symbiose und auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die DNA-Reparaturmechanismen bei den meisten Blattknöllchensymbionten noch intakt sind. Der durchschnittliche GC-Prozentsatz von Pseudogenen, von dem man annehmen könnte, dass er einer entspannten Selektion unterliegt, unterscheidet sich jedoch nicht wesentlich von dem von funktionellen Genen (Ergänzungstabelle S2). In anderen Organismen haben Pseudogene einen geringeren GC-Prozentsatz als ihre funktionellen Gegenstücke (Lerat und Ochman, 2004). Diese fehlende Abweichung vom durchschnittlichen GC% lässt stattdessen darauf schließen, dass die Substitutionen bei Burkholderia-Blattknotensymbionten nicht auf A+T ausgerichtet sind. Diese Interpretation wird durch experimentelle Daten gestützt, die eine ungewöhnliche Mutationsverzerrung in Richtung G+C bei anderen Burkholderia-Arten belegen (Dillon et al., 2015).

Wir haben das Kerngenom von Blattknöllchensymbionten berechnet und es mit dem Kerngenom von 52 frei lebenden Burkholderiaceae-Arten verglichen, die als Annäherung an den essentiellen Gensatz von Burkholderia-Arten dienen (Juhas et al., 2012). Das Kerngenom von Blattknöllchensymbionten enthält 798 Gene und nur sieben Burkholderiaceae-Kerngene fehlten in allen Blattknöllchensymbiontengenomen. Allerdings scheint keiner von ihnen zu einem essentiellen Stoffwechselweg zu gehören (Ergänzungstabelle S3), was darauf hindeutet, dass Blattknotensymbionten trotz der weit verbreiteten Genomreduktion möglicherweise nicht für wesentliche Haushaltsfunktionen vom Wirt abhängig sind. Dies bestätigt indirekt die frühere Annahme, dass die Unfähigkeit, Blattknöllchenbakterien axenisch zu vermehren, auf deren mangelnde Anpassungsfähigkeit an veränderte Umweltbedingungen zurückzuführen sein könnte (Carlier und Eberl, 2012).

Wir untersuchten auch die Menge der nicht-essentiellen Gene (akzessorische Gene frei lebender Burkholderia), die in allen Blattknöllchen-Symbiontengenomen konserviert sind, um spezifische Wege zu finden, die für die Symbiose oder für das Leben als Endophyt wichtig sein könnten. Wir identifizierten 314 nicht-essentielle Gene, die hauptsächlich am Coenzym-Metabolismus sowie an der Biogenese der Zellhülle und der äußeren Membran beteiligt sind und in allen Blattknoten-Symbionten von Rubiaceae konserviert waren (Ergänzungsabbildung S4, Ergänzungstabelle S4).

Unter den Genen, die am Coenzym-Stoffwechsel beteiligt sind, konnten wir vollständige Wege für die Biosynthese von Thiamin, Cobalamin und Glutathion identifizieren. Es ist bekannt, dass diese Vitamine die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben fördern und könnten daher möglicherweise für die obligate Natur der Blattknotensymbiose wichtig sein. Es gibt nur einen beschriebenen Fall einer Cobalamin-abhängigen Symbiose, nämlich zwischen der Alge Volvox carteri und ihrem Cyanobakterien-Symbionten (Helliwell et al., 2011). Im Gegensatz zu Algen benötigen höhere Pflanzen kein Cobalamin und sind auch nicht in der Lage, es zu produzieren. Die Cobalamin-Biosynthese ist nur auf Bakterien beschränkt, bei denen das Vitamin als Cofaktor für mehrere Enzyme wie die Methionin-Synthase fungiert (Banerjee und Ragsdale, 2003). Blattknotensymbionten behalten die Cobalamin-abhängige Version der Methioninsynthase und einen vollständigen Cobalamin-Biosyntheseweg. Die Mengen an freiem Met in Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Analysen von Extrakten des aposymbiotischen P. kirkii waren nicht von denen von knotigen Pflanzen zu unterscheiden, was darauf hindeutet, dass Blattknotensymbionten Met synthetisieren, um ihre eigenen Stoffwechselbedürfnisse und nicht die des Wirts zu erfüllen (Daten nicht gezeigt).

Bakterielle Antioxidantien können als Abwehrmechanismus gegen pflanzliche reaktive Sauerstoffspezies wirken (Nanda et al., 2010). Die Relevanz von enzymatischen und nicht-enzymatischen reaktiven Sauerstoffspezies-Fängern wie dem Superoxiddismutase-Enzym und Glutathion bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben hat sich bei Hülsenfrucht-Rhizobium-Symbiosen als wichtig erwiesen (Santos et al., 2000; Rubio et al., 2004; Pauly et al., 2006). Diese Abfangfunktionen (z. B. Superoxiddismutase) sind in allen Blattknötchensymbionten konserviert, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise auch eine wichtige Rolle für die Symbiose und möglicherweise die Knötchenbildung spielen (Ergänzungstabelle S4). Alternativ könnten Mechanismen zum Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies vorhanden sein notwendig, um in der rauen, photooxidativen Umgebung des Blattes zu überleben (Triantaphylidès et al., 2008).

Wie bereits erwähnt, teilen Blattknoten-Symbionten nicht-essentielle Gene, die für die Biosynthese von Lipopolisacchariden (LPS) verantwortlich sind, die für die Wirt-Symbionten-Erkennung wichtig sein können (Raetz und Whitfield, 2002). Lipopolisaccharide sind „mikrobenassoziierte molekulare Muster“, die den Hauptbestandteil der Zelloberfläche bilden (Boller und Felix, 2009). Sie gelten als erste Barriere gegen pflanzliche Abwehrkräfte und vermitteln die Kommunikation mit der Wirtspflanze (Soto et al., 2009). Da die Blattknotensymbionten Pflanzenarten derselben Familie besiedeln, wurde eine ähnliche strukturelle Zusammensetzung des O-Antigens erwartet. Allerdings ist der Cluster, der möglicherweise an der Assemblierung, Modifikation und dem Export beteiligt ist (Bkir_c27_1818–1838), nicht in allen Blattknötchen vollständig konserviert und einigen von ihnen fehlt sogar ein Glykosyltransferase-Enzym (Bkir_c27_1818), das vermutlich an der Assemblierung des O-Antigens beteiligt ist. Das Fehlen eines konservierten Clusters für die Synthese von O-Antigen in Blattknotensymbionten schließt die Möglichkeit nicht vollständig aus, dass Lipopolisaccharid an der symbiotischen Kommunikation beteiligt ist. Allerdings scheint Lipopolisaccharid nicht der Hauptmediator zu sein und andere mikrobenassoziierte molekulare Muster (z. B. GroEL, Elongationsfaktor, Peptidoglycan usw.) könnten an der Erkennung des Symbionten beteiligt sein (Newman et al., 2013; Chaudhary et al., 2014).

Die vertikale Übertragung bakterieller Symbionten durch die Keimbahn des Wirts ist eine der am weitesten verbreiteten Strategien zur Aufrechterhaltung einer obligaten Symbiose und führt häufig zu phylogenetischer Kongruenz oder Kospeziation zwischen Partnern (Moran et al., 1993; Russell und Moran, 2005). ; Sloan und Moran, 2012). Trotz Wirtsspezifität und vertikaler Übertragung der Blattknotensymbionten sind die Phylogenien der Rubiaceae-Arten und ihrer Burkholderia-Symbionten inkongruent. Um diesen Mangel an strikter Koevolution zu erklären, wurde ein vertikaler Übertragungsmodus mit gelegentlicher horizontaler Übertragung vorgeschlagen (Lemaire et al., 2011). Darüber hinaus lässt die Verflechtung von Burkholderia-Bodenisolaten und Insektensymbionten innerhalb der phylogenetischen Gruppe von Blattknöllchensymbionten auf mehrere Übertragungsquellen (Pflanzen, Insekten und Boden) schließen.

Inkongruenzen zwischen den Phylogenien von Wirten und Symbionten legen nahe, dass die Übertragungsart der Bakterien gemischt und nicht streng vertikal ist (Abbildung 4). Am interessantesten ist, dass wir einen auffälligen Wirtswechsel oder eine erneute Infektion zwischen P. kirkii/Ca. B. kirkii und die Pa. schumanniana/Ca. B. schumanniana-Artenpaare. Die bakteriellen Symbionten sind eng miteinander verwandt und weisen einen ähnlichen Grad der Genomreduktion auf, obwohl sie vor <300.000 Jahren auseinander gingen (ergänzende Abbildung S5). Allerdings gehören P. kirkii und Pa. schumanniana zu unterschiedlichen Gattungen, von denen angenommen wird, dass sie sich vor >60 Millionen Jahren auseinander entwickelt haben (Lemaire et al., 2011). Die einfachste Erklärung ist, dass der Symbiont von Pa. schumanniana kürzlich durch den Blattknotensymbionten von P. kirkii ersetzt wurde. Die Möglichkeit einer erneuten Infektion durch Bakterien, die in einem Bodenreservoir leben, wie zuvor angenommen (Lemaire et al., 2012), erscheint unwahrscheinlich. Der hohe Grad der Genomreduktion sowie die sehr hohe Sequenzhomologie, die zwischen den Genomen der Symbionten von Pa. schumanniana und P. kirkii beobachtet wurde, lassen eher darauf schließen, dass beide Arten seit Millionen von Jahren auf einen Wirt beschränkt waren. Die Wahrscheinlichkeit von Wirtswechselereignissen kann durch die Überlappung der geografischen Verbreitungsgebiete von P. punctata, P. kirkii und Pa. schumanniana erhöht werden (Bremekamp, ​​1934; Lachenaud, 2013).

Phylogenetische Maximum-Likelihood-Rekonstruktion von Burkholderia-Arten (links) und Psychotria-Arten (rechts). Der Burkholderia-Baum wurde auf der Grundlage der Analyse einer verketteten Ausrichtung von 534 echten orthologen Genen rekonstruiert. Die Rekonstruktion der Psychotria-Pflanzenart basierte auf einem 30 kb großen Chloroplasten-konservierten Fragment. In Grün sind die Blattknoten-Bakteriensymbionten der Pflanzenart Psychotria hervorgehoben. Der Blattknöllchen-Bakteriensymbiont der Pavetta-Pflanzenart ist blau hervorgehoben. Rot hervorgehoben ist ein Symbiont von Riptortus (Stinkwanze) und in Braun Bodenisolate. Burkholderia ambifaria AMMD wurde als Fremdgruppe verwendet (nicht gezeigt). Bootstrap-Werte werden angezeigt.

Ein Hinweis auf den Mechanismus der Symbiontenübertragung zwischen Pflanzen könnte von der verschachtelten Gruppe von Bodenisolaten (B. sp. YI23 und B. sp. SJ98) und dem Stinkwanzen-Symbionten Riptortus pedestris (B. sp. RPE64) stammen, die eine Schwester bilden Gruppe mit Ca. B. punctata, Ca. B. kirkii und Ca. B. schumanniana (Abbildung 4). Burkholderia-Isolate, B. sp. YI23 und B. sp. SJ98 wurden aus dem Boden isoliert und sind in der Lage, die Pestizide 2-Chlor-4-nitrophenol (in B. sp. SJ98) (Min et al., 2014) und Fenitrothion (in B. sp. YI23) (Lim et al.) abzubauen al., 2012). B. sp. RPE64 wurde aus Stinkwanzen isoliert (Kikuchi et al., 2012). Diese Gruppe von Burkholderia-Arten, zu der die Blattknöllchensymbionten der Rubiaceae gehören, leben frei im Boden oder sind mit Pflanzen und Insekten vergesellschaftet. Daher kann man sich vorstellen, dass der Vorfahre der Blattknotensymbionten eine Burkholderia-Art mit einem bemerkenswert breiten Wirtsspektrum war. Es ist daher denkbar, dass einige der Blattknöllchenarten die Fähigkeit zur vorübergehenden Assoziation mit Insekten behalten haben, die als potenzielle Vektoren fungieren könnten (während Nicht-Vektorinsekten Ziele der insektiziden Wirkung von Kirkamid sein könnten).

Um einen besseren Einblick in die Determinanten der Blattsymbiose zu erhalten, haben wir uns auf die Gene konzentriert, die nur bei Blattknöllchensymbionten vorhanden sind und bei anderen eng verwandten Burkholderia-Arten fehlen. Der Genomvergleich der bakteriellen Blattknötchen-Symbionten mit 19 eng verwandten Burkholderia-Arten ergab nur ein Gen, das für die Blattknötchen-Linie einzigartig ist. Dieses Gen kodiert für eine mutmaßliche 2-Epi-5-Epi-Valiolon-Synthase, die am ersten Schritt der von 2-Epi-5-Epi-Valiolon abgeleiteten Aminocyclitole aus der C7N-Aminocyclitol-Familie beteiligt ist. Eine genauere Untersuchung ergab, dass das Gen in Ca verkürzt ist. B. brachyanthoides, und die Biosynthese von C7N-Aminocyclitolen scheint bei dieser Art verloren gegangen zu sein (Tabelle 2). Das Kerngenom der sieben anderen Genome enthält jedoch möglicherweise einen Satz von sechs Genen (2-Epi-5-Epi-Valiolon-Synthase, N-Acetylmannosamin-Kinase, Zuckerhydrolase, Glykosidase, Zuckerdehydrogenase, Gcn5-verwandte N-Acetyltransferase-Familie). an der Synthese des Kirkamid-Moleküls beteiligt (Tabelle 2). Fast alle Gene sind konserviert und liegen in der gleichen Genreihenfolge vor, nur die Acetyltransferase befindet sich an einer anderen Stelle in Ca. B. humilis. Interessanterweise wird dieser Gencluster in einigen Fällen von Resten transponierbarer Elemente flankiert (Ergänzende Abbildung S6).

Da der gemeinsame Vorfahre aller modernen Rubiaceae-Blattknotensymbionten wahrscheinlich über einen C7N-Aminocyclitol-Sekundärstoffwechsel verfügte, spekulieren wir, dass der Erwerb der Fähigkeit, diese schützende Verbindung zu synthetisieren, den Übergang von vielleicht einem kommensalen zu einem wechselseitigen Lebensstil ermöglichte. Der Sekundärstoffwechsel und der damit verbundene Fitnessvorteil allein erklären jedoch nicht die strikte Abhängigkeit der Wirtspflanze von der Anwesenheit von Bakterien, die sich möglicherweise unabhängig voneinander entwickelt haben (De Mazancourt et al., 2001; Leigh, 2010; Sachs et al., 2011). ).

Um dies zu testen, haben wir Blattextrakte mittels GC-MS und 1H-NMR auf Kirkamid untersucht (siehe ergänzende Informationsmethoden). Wir konnten Kirkamid im Blattextrakt von P. kirkii, P. punctata, P. verschuerenii, P. humilis und P. pumila nachweisen (Tabelle 2, ergänzende Abbildungen S2D und E) und die Konzentrationen lagen im Bereich von 0,2 bis 0,4 % des Trockengewichts bestimmt in Blättern von P. kirkii und P. punctata. Alle diese Arten beherbergen den mutmaßlichen Kirkamid-Biosyntheseweg. Im Gegensatz dazu konnten wir Kirkamid in Extrakten von P. brachyanthoides nicht nachweisen, dessen Symbionten den größten Teil des Kirkamid-Biosyntheseclusters verloren haben. Wir konnten Kirkamid auch nicht in Extrakten von Pa. schumanniana und P. umbellata nachweisen, da beide Arten die Enzyme des Kirkamid-Signalwegs enthalten (Tabelle 2, ergänzende Abbildungen S2D und E). Interessanterweise ist ein mutmaßliches Transportergen der Major Facilitator-Superfamilie, das an das Kirkamid-Operon gebunden ist, ein Pseudogen in Ca. B. umbellata. Das orthologe Gen in Ca. B. schumanniana wird nach IS-vermittelter Umlagerung vom Haupt-Kirkamid-Operon abgetrennt. Daher ist es möglich, dass der Transport von Kirkamid oder Vorläufern in beiden Organismen beeinträchtigt ist. Eine alternative Hypothese besagt, dass in P. umbellata und Pa. schumanniana ein weiteres unentdecktes C7N-Aminocyclitol produziert wird. Wir könnten beispielsweise eine neue C7-Cyclitol-Verbindung, Streptolglucosid (Ergänzungsabbildung S2A), aus Blättern von P. kirkii isolieren. Die Struktur ist im anomeren Zentrum epimer im Vergleich zu A-79197–2, das aus einer epiphytischen Actinomyces-Art isoliert wurde (Kizuka et al., 2002) (Ergänzende Abbildung S2F). Da Streptolglucosid die Keimung von Salatsamen stark hemmt (bestätigt mit der gereinigten Verbindung aus P. kirkii), könnte es P. kirkii einen allelopathischen Vorteil verleihen (siehe ergänzende Informationsmethoden). Das Enzymrepertoire der Wirtspflanze könnte auch zur Vielfalt der durch die Assoziation produzierten Sekundärmetaboliten beitragen.

Das Fehlen einer vollständigen Syntenie in den konservierten Sekundärmetabolit-Genen und das Vorhandensein flankierender transponierbarer Elemente lassen darauf schließen, dass HGT-Ereignisse aufgetreten sein könnten. Dies wird auch durch die Inkongruenz der Genphylogenien gestützt, die auf mehrere HGT-Ereignisse innerhalb der Klade der Blattknöllchensymbionten hinweist (ergänzende Abbildung S7). Obwohl die C7N-Aminocyclitol-Biosynthese wahrscheinlich beim Vorfahren der modernen Blattknotensymbionten vorhanden war, scheint HGT mindestens zweimal stattgefunden zu haben (ergänzende Abbildung S8). Da sich die mutmaßlichen Kirkamid-Biosynthesegene auf dem Plasmid pKIR01 in Ca befinden. B. kirkii, könnte der konjugative Transfer die gemischten phylogenetischen Bäume der Sekundärstoffwechselgene der Blattknotensymbionten erklären. Wir haben zuvor das repA-Gen von pKIR01 identifiziert, das sich in unmittelbarer Nähe eines parA/parB-Partitionsgenpaars befindet und möglicherweise für ein Replikationsinitiationsprotein kodiert (Carlier und Eberl, 2012; Carlier et al., 2013). Wir konnten vollständige oder teilweise Sequenzen von repA-Homologen aus allen Genomen von Blattknotensymbionten abrufen (ergänzende Abbildung S9). Bemerkenswerterweise konnten wir zwei Kopien von repA im Genom von Ca nachweisen. B. kirkii, von denen eines ein Pseudogen ist und zu einem bestimmten Zweig des repA-Baums gehört. Dies ist ein klarer Beweis dafür, dass der Erwerb des pKIR01-Replikons in Ca mindestens zweimal stattfand. B. kirkii. Darüber hinaus finden wir kaum Hinweise auf eine Koevolution zwischen den repA-Genen und den übrigen Genomen, mit Ausnahme von Ca. B. punctata, Ca. B. kirkii und Ca. B. schumanniana. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Übertragung des pKIR01-Replikons bei Blattknötchensymbionten häufig vorkommt und die vermutete HGT von C7N-Aminocyclitol-Biosynthesegenen bei Blattknötchensymbionten erklären könnte.

Der Erwerb der Produktion sekundärer Metaboliten durch HGT wurde in anderen Symbiosen dokumentiert, insbesondere in der insektenabwehrenden Symbiose, die bei der asiatischen Zitrusblattlaus Diaphorina citri auftritt (Nakabachi et al., 2013b). Darüber hinaus wurden HGT-Ereignisse zwischen dem obligaten intrazellulären Symbionten Candidatus Profftella armatura und dem Phloem-beschränkten Pathogen „Candidatus Liberibacter asiaticus“ vermutet (Nakabachi et al., 2013a). Der Zeitpunkt der HGT-Ereignisse ist in diesen Beispielen jedoch unklar. Unsere Daten deuten stark darauf hin, dass die HGT von Kirkamid-Synthesegenen auch nach der ersten Entwicklung der Blattknotensymbiose noch auftrat. Intra-Clade-HGT sind bei obligat symbiotischen Bakterien selten, aber HGT von Bakteriophagen-verwandten Genen wurden bei fakultativen Wolbachia-Insektensymbionten dokumentiert, von denen auch bekannt ist, dass sie ihre Wirte koinfizieren (Bordenstein und Wernegreen, 2004). Wir dokumentieren hier den ersten Fall eines horizontalen Gentransfers innerhalb der Gruppe, der offenbar eine zentrale Rolle bei der obligaten Blattknotensymbiose spielt.

Obwohl sich die Genome aller Blattknöllchen-Symbionten in einem ähnlichen Erosionszustand befinden, konnten wir eine gewisse Variabilität in ihrer Kodierungskapazität beobachten, was auf eine dynamische und anhaltende Genomreduktion hinweist. Unsere Daten zeigen auch, dass in den frühen Stadien der Genomreduktion immer noch eine begrenzte HGT innerhalb der Klade auftreten kann. Das vorübergehende Zusammenleben von Symbionten und der konjugative Plasmidtransfer könnten das Vorhandensein von HGT in Blattknotensymbionten erklären. Tatsächlich liefern unsere Daten Belege für eine Art der Übertragung der Symbionten, die nicht streng vertikal ist. Wir schlagen Insekten als mögliche Vektoren für die horizontale Übertragung von Blattknöllchenbakterien auf neue Wirte vor. Wirtswechselereignisse könnten zu einem vorübergehenden Zusammenleben verschiedener Bakterienarten innerhalb eines Blattknöllchens führen und dadurch die HGT unter Blattknöllchensymbionten fördern.

Unsere Daten legen nahe, dass plasmidvermittelte HGT bei Blattknotensymbionten häufig vorkommt. Wir gehen jedoch davon aus, dass der Austausch von genetischem Material aufgrund der Divergenz von Blattknöllchenbakterien aufgrund der Einengung des Wirtsbereichs von Plasmiden oder des Verlusts der Fähigkeit, einen Insektenvektor zu besiedeln, eingeschränkt wird. Tatsächlich zeigen unsere Daten, dass Plasmide der pKIR01-Gruppe in das Chromosom integriert werden können, was einen weiteren genetischen Austausch verhindert. In dieser Hinsicht bieten die Genome von Blattknöllchensymbionten eine einzigartige Möglichkeit, die frühen Stadien der Genomreduktion nach dem Übergang zu einem obligaten symbiotischen Lebensstil zu untersuchen.

In dieser Studie haben wir beobachtet, dass nicht alle Blattknotensymbionten in der Lage sind, Kirkamid zu produzieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Kirkamid eine wichtige Abwehrfunktion hat, aber nicht für den obligaten Charakter der Symbiose verantwortlich ist. Interessanterweise ergab eine kürzlich durchgeführte phylogenetische Studie an blattknotigen Arten von Psychotria das Vorhandensein von zwei nichtknotigen Pflanzenarten (P. tetragonopus und P. limba) innerhalb der knötchenförmigen Gruppe, was darauf hindeutet, dass bei diesen Arten symbiotische Merkmale verloren gegangen sind (Lachenaud, 2013). ).

Unsere genomische Studie stimmt vollständig mit anderen Studien überein, die den Ursprung der Blattknotensymbiose auf das Miozän zurückdatieren (im Bereich von 5,5–13,82 Mya) (Ergänzungsabbildung S5) (siehe ergänzende Informationsmethoden) (Lemaire et al., 2011; Barrabé et al., 2014). Die obligate Interaktion zwischen Blattknotensymbionten und ihrer Wirtspflanze könnte sich aus einer anfänglichen fakultativen und kommensalen Assoziation entwickelt haben (Abbildung 5). Der Erwerb der Sekundärmetabolitensynthese durch die symbiotischen Bakterien könnte wahrscheinlich für den Übergang zu einer wechselseitigen Interaktion und die Etablierung der Blattknotensymbiose von wesentlicher Bedeutung gewesen sein. Anschließend wurde die Assoziation dauerhaft und die Bakteriengenome begannen zu erodieren. Die Isolierung von Zwischenstadien der Symbiose könnte wertvolle Informationen zu diesem Prozess liefern. Es wäre daher interessant, die Genomeigenschaften der kürzlich beschriebenen Burkholderia-Endophyten nicht knotiger Rubiaceae-Pflanzen zu untersuchen (Verstraete et al., 2013).

Evolutionsgeschichtliche Hypothese für die Blattknotensymbiose. Vorfahren der modernen Psychotria sp. standen wahrscheinlich in vorübergehender Verbindung mit endophytischen oder möglicherweise epiphytischen kommensalen Bakterien. Vor etwa 5,5–13,8 Millionen Jahren erwarben die Bakterien Gene für die Produktion schützender Sekundärmetaboliten, was dem Verein einen Netto-Fitnessvorteil verschaffte. Als effektivere Symbionten ausgewählt wurden, wurden die symbiotischen Bakterien vertikal übertragen, wodurch die Symbiose dauerhaft wurde. Eine Folge dieser permanenten Assoziation ist die erhöhte Abhängigkeit des Wirts von den Blattknöllchenbakterien, möglicherweise durch den Verlust redundanter Stoffwechselwege. Alle beschriebenen modernen knotigen Psychotria-Arten stehen in einer engen Beziehung zu den Blattknotenbakterien, unabhängig von der Produktion schützender Metaboliten. Die gestrichelt dargestellten Zwischenstadien (mutualistische Burkholderia-Symbionten, knotige Rubiaceae mit fakultativen Symbionten) sind hypothetisch.

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Wir danken Rolf Kümmerli und Kentaro Shimizu für ihre Hilfe und Kommentare zum Manuskript. MPC dankt dem UFSP Evolution in Action der Universität Zürich für seine Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds im Rahmen des Stipendiums CRSII3_154430 unterstützt.

Abteilung für Pflanzen- und Mikrobenbiologie, Universität Zürich, Zürich, Schweiz

Marta Pinto-Carbó, Thomas Wicker, Leo Eberl & Aurelien Carlier

Fachbereich Chemie, Universität Basel, Basel, Schweiz

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Steven Dessein & Brecht Verstraete

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Steven Dessein & Brecht Verstraete

Institut für Chemie, Universität Zürich, Zürich, Schweiz

Karl Gademann

Labor für Mikrobiologie, Universität Gent, Belgien, 9000, Schweiz

Aurelien Carlier

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Korrespondenz mit Aurelien Carlier.

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Ergänzende Informationen liegen diesem Dokument auf der Website des ISME Journal bei

Nachdrucke und Genehmigungen

Pinto-Carbó, M., Sieber, S., Dessein, S. et al. Hinweise auf einen horizontalen Gentransfer zwischen obligaten Blattknotensymbionten. ISME J 10, 2092–2105 (2016). https://doi.org/10.1038/ismej.2016.27

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Eingegangen: 27. September 2015

Überarbeitet: 29. Dezember 2015

Angenommen: 12. Januar 2016

Veröffentlicht: 15. März 2016

Ausgabedatum: September 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/ismej.2016.27

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