Das eINTACT-System untersucht die bakterielle Ausnutzung pflanzlicher Osmosignale zur Steigerung der Virulenz

Nature Plants Band 9, Seiten 128–141 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bakterien injizieren Effektorproteine ​​in Wirtszellen, um zelluläre Prozesse zu manipulieren, die Krankheiten fördern. Da Bakterien nur winzige Mengen an Effektoren in Zielzellen des Wirts abgeben, ist es technisch schwierig, effektorabhängige zelluläre Veränderungen aus massenhaft infizierten Wirtsgeweben zu erfassen. Hier berichten wir über eine neue Technik namens effektorinduzierbare Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (eINTACT), die die affinitätsbasierte Reinigung von Kernen aus Arabidopsis-Pflanzenzellen erleichtert, die Xanthomonas-Bakterieneffektoren erhalten haben. Die Analyse gereinigter Kerne zeigt, dass der Xanthomonas-Effektor XopD die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Abscisinsäure-Signalisierung von Arabidopsis manipuliert und OSCA1.1 aktiviert, ein Gen, das einen kalziumdurchlässigen Kanal kodiert, der für den Stomatenverschluss als Reaktion auf osmotischen Stress erforderlich ist. Der Verlust von OSCA1.1 führt zum Welken der Blätter und zu einem verringerten Bakterienwachstum in infizierten Blättern, was darauf hindeutet, dass OSCA1.1 die Anfälligkeit des Wirts fördert. Mit eINTACT können wir aufdecken, dass XopD den durch Osmosignalisierung durch Osmosignalisierung vermittelten Stomata-Verschluss des Wirts ausnutzt, um einen feuchten Lebensraum zu schaffen, der das Bakterienwachstum begünstigt und einen neuen Weg für die genaue Aufklärung der Funktionen von Effektoren zahlreicher gramnegativer Pflanzenbakterien in einheimischen Pflanzen eröffnet Infektionskontexte.

Bakterielle Krankheitserreger dringen über natürliche Öffnungen (zum Beispiel Stomata oder Hydathoden) oder Wunden in Wirtspflanzen ein und vermehren sich anschließend im apoplastischen Raum zwischen Zellen oder in den Gefäßen1,2. Um die Infektion zu erleichtern, injizieren virulente gramnegative Bakterien mithilfe eines spritzenähnlichen Multiproteinkomplexes, dem Typ-III-Sekretionssystem (T3SS)3, Effektoren in Wirtszellen. Innerhalb der Wirtszellen lokalisieren sich Effektoren in bestimmten subzellulären Kompartimenten und manipulieren die zellulären Prozesse des Wirts, um die Immunität des Wirts zu unterdrücken und/oder eine Umgebung zu schaffen, die das Wachstum oder die Ausbreitung von Bakterien begünstigt4,5. Aktuelle Studien zu bakteriellen Krankheitserregern legen nahe, dass die Schaffung eines wässrigen apoplastischen Raums in Pflanzen für die bakterielle Virulenz von entscheidender Bedeutung ist6. Tatsächlich wurden einige Effektoren identifiziert, die Krankheiten fördern, indem sie einen erhöhten Wasserspiegel in infizierten Geweben verursachen, wie z. B. Pseudomonas syringae HopM16, Xanthomonas gardneri AvrHah17 und Xanthomonas translucens Tal88. Aufgrund der Vielfalt der Effektoren in phylogenetisch unterschiedlichen Bakteriengattungen bleiben die molekularen Mechanismen, die der effektorvermittelten Anfälligkeit von Pflanzen zugrunde liegen, weitgehend rätselhaft.

Xanthomonas campestris pv. Der Campestris-Stamm 8004 (Xcc8004) ist ein blattvaskulärer Krankheitserreger, der in vielen Brassica-Pflanzen und der Modellpflanze Arabidopsis2 die Schwarzfäulekrankheit verursacht. Eines seiner Effektorproteine, das Xanthomonas-Außenprotein D (XopDXcc8004, in dieser Studie XopD), ist ein im Kern lokalisiertes Typ-III-Effektorprotein, das drei N-terminale pflanzenspezifische Ethylen-responsive Element-Bindungsfaktor-assoziierte amphiphile Repression (EAR) enthält. Motive, die normalerweise die Stummschaltung der Transkription in Planta vermitteln, und eine C-terminale Cysteinproteasedomäne9 (Extended Data Abb. 1). Interessanterweise berichteten zwei frühere Studien über unterschiedliche Aktivitäten von XopD in Arabidopsis10,11. Eine Studie zeigte, dass XopD Krankheiten fördert, indem es die frühe Blattnekrose unterdrückt, aber das Bakterienwachstum in den infizierten Arabidopsis-Blättern nicht beeinflusst10. Über seine EAR-Motiv-enthaltende Domäne interagiert XopD mit Arabidopsis-DELLA-Proteinen und stabilisiert diese, die wichtige Transkriptionsrepressoren von Genen sind, die auf Gibberellinsäure (GA) reagieren10. Die XopD-DELLA-Wechselwirkung verursacht jedoch keine erkennbaren Veränderungen in den Mengen der GA-responsiven Transkripte10. Umstritten ist, dass in einer anderen Studie eine Avirulenzwirkung von Darüber hinaus wurde in vitro festgestellt, dass XopD aufgrund seiner geringen Ubiquitin-like-Modifier (SUMO)-Proteaseaktivität mit Arabidopsis HFR1, einem Transkriptionsfaktor (TF), der an der Phytochrom-Signalübertragung beteiligt ist, interagiert und dieses deSUMOyliert11. Zusammengenommen legen beide früheren Studien nahe, dass XopD die Aktivität pflanzlicher TFs und Wirts-Phytohormon-Signalwege modulieren könnte. Dennoch sind die molekularen Mechanismen, die den genauen Funktionen von XopD in der Pflanze zugrunde liegen, noch nicht schlüssig.

Wir haben versucht, diese mehrdeutigen molekularen Mechanismen zu identifizieren und zu charakterisieren; Aktuelle experimentelle Ansätze, die darauf abzielen, die Funktionen bakterieller Effektoren in Pflanzen aufzudecken, ignorieren jedoch meist die zelluläre Komplexität infizierter Pflanzengewebe. Beispielsweise injizieren bakterielle Krankheitserreger nach dem Eintritt in den apoplastischen Raum im Mesophyll ihre Effektoren nur in Pflanzenzellen, die vom apoplastischen Lumen aus zugänglich sind3. Die benachbarten Zellen können einige Effektoren empfangen, die sich von den Zellen, die Effektoren direkt empfangen, über Plasmodesmen bewegen; Allerdings dürfte der Konzentrationsgradient steil sein12. Es ist denkbar, dass sich die durch Effektoren verursachten Veränderungen in diesen benachbarten Zellen quantitativ unterscheiden, abhängig von den Funktionen und Mengen der spezifischen Effektoren, die sich durch Plasmodesmen bewegen. Derzeit verwenden die meisten Studien massenhaft infiziertes Wirtsgewebe als Ausgangsmaterial, das aus einer Mischung von Effektor-Empfänger- und Nicht-Empfänger-Wirtszellen besteht, was unweigerlich zu einer Verdünnung der durch Effektoren verursachten Zellveränderungen führt, möglicherweise bis zu einem nicht nachweisbaren Ausmaß. Alternativ wird üblicherweise die transgene Expression von Effektorgenen unter konstitutiven oder induzierbaren Promotoren verwendet, um deren Funktionen in der Pflanze anzunähern. Die ektopische Überexpression von Effektoren in Pflanzen ist zwar einfach und nützlich, lässt jedoch die Tatsache außer Acht, dass Bakterien typischerweise nur winzige Mengen an Effektorproteinen in Zielwirtszellen abgeben, wodurch möglicherweise Effektorfunktionen verdeckt werden, die empfindlich auf Dosisabhängigkeit, räumlich-zeitliche Infektionsdynamik und zelluläre Spezifität reagieren4 ,13,14. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen experimentellen Techniken, die die Analyse der bakteriellen Effektorfunktionen in den Zellen ermöglichen, die Effektoren direkt über T3SS-vermittelte Abgabe in nativ infizierten Wirtsgeweben empfangen.

Um die technischen Einschränkungen der derzeit verwendeten Methoden zur Funktionsanalyse von Effektoren in Planta zu überwinden, haben wir eine neue Technik entwickelt, die effektorinduzierbare Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (eINTACT), um Kerne selektiv aus Effektor-Empfängerzellen infizierter Zellen zu gewinnen Arabidopsis-Pflanzen (Abb. 1a,b). eINTACT basiert auf der transkriptionellen Aktivierung eines transgenkodierten biotinylierten Kernhüllen-Targeting-Proteins (NTF)15,16,17 durch Effektoren, die Bakterien in pflanzliche Zielzellen injizieren. In der neu etablierten eINTACT-Reporter-Arabidopsis-Linie steht die Expression des NTF-Transgens unter der Kontrolle des transkriptionell stillen Promotors des Pfeffer-Bs3-Gens (Bs3p), der durch den bakteriellen Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Effektor AvrBs3 aus Xanthomonas euvesicatoria (Xe )18. Der bakterielle Erreger Xcc wird verwendet, um AvrBs3 in Arabidopsis-Zellen einzuschleusen, um den NTF-Reporter zu aktivieren. Um einen von Xcc abgeleiteten Stamm namens Xcc* zu erzeugen, der auf Arabidopsis vollständig virulent ist, haben wir die bakteriellen Gene gelöscht, die für die Effektoren AvrAC und Wir haben Xcc* mit einem pDSK-Vektor transformiert, der avrBs3 unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors enthält, was Xcc*AvrBs3 ergab. Daher liefert Xcc*AvrBs3 AvrBs3 zusammen mit anderen Xcc*-Effektoren in der eINTACT-Reporterlinie von Arabidopsis, was zur Transkriptionsaktivierung von Bs3p und zur Expression des nachgeschalteten NTF ausschließlich in Effektor-Empfänger-Wirtszellen führt. Eine durch das Transgen kodierte, konstitutiv exprimierte Biotin-Ligase vermittelt die Biotin-Markierung des NTF-Proteins und erleichtert die Affinitätsreinigung von Biotin-dekorierten Kernen aus Wirtszellen, die auf den Effektor abzielen, mithilfe von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen, wie in der INTACT-Methode beschrieben15,16,17 (Abb. 1b).

a, Schematische Darstellung des Arabidopsis-Xcc eINTACT-Systems (Ergänzungstext). b, Isolierung der mit Biotin markierten Kerne unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen durch affinitätsbasierte Reinigung (INTACT-Methode, Ergänzungstext). c, Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Nachweis der NTF-Expression in mit Xcc*vec1 und Xcc*AvrBs3 infizierten Blättern, sieben Tage nach der Infektion (DPI). Der Ausdruck von TUB2 wird als Kontrolle verwendet. d–f, Mikroskopbilder von Blattzellen, die Xcc*AvrBs3-Effektoren erhalten haben. Maßstabsbalken, 50 μm. g–i Mikroskopbilder von eINTACT-gereinigten Kernen (angezeigt durch weiße Dreiecke) aus Xcc*AvrBs3-infizierten Blättern. Maßstabsbalken, 100 μm. In Mikroskopiebildern gibt BF das Hellfeld (d,g) an; magnetische Perlen erscheinen als weiße Kugeln (g); Mit DAPI gefärbte DNA ist blau dargestellt (e,h); und mit rotem NTF markierte Kernhüllendomänen werden durch mCherry-Fluoreszenz (f, i) nachgewiesen. Drei Wiederholungen jedes Experiments (c–i) wurden unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Als Proof-of-Concept haben wir die eINTACT-Reporterlinie mit Xcc*AvrBs3 und einem isogenen Stamm geimpft, der den leeren pDSK-Vektor ohne avrBs3 (Xcc*vec1) enthält. Da Xcc ein vaskulärer Krankheitserreger ist, inokulierten wir in unserer Studie die Arabidopsis-Blätter, indem wir die zentrale Blattvene mit einer Xcc-kontaminierten Nadel verletzten19. Sieben Tage nach der Infektion (DPI) stellten wir eine Akkumulation von NTF-mRNA nur in Xcc*AvrBs3, nicht jedoch in mit Xcc*vec1 inokulierten Blättern fest (Abb. 1c), was zeigt, dass die NTF-Expression streng von AvrBs3 abhängig ist. Darüber hinaus ergab die mikroskopische Untersuchung von Xcc*AvrBs3-infizierten Blättern rot fluoreszierendes NTF-Protein an den Kernhüllen von Effektor-Empfängerzellen (Abb. 1d – f), und Western Blot zeigte eine Anreicherung des NTF-Proteins in eINTACT-gereinigten Kernen (Extended Data). Abb. 2a). Darüber hinaus entwickelten Xcc*AvrBs3-infizierte Blätter der eINTACT-Reporterlinie normale V-förmige Chlorose-Krankheitssymptome und beherbergten eine ähnliche Menge an Bakterienpopulation wie Xcc*vec1-infizierte Wildtyp-Col-0-Blätter (Extended Data Abb. 2b und c). Unsere Ergebnisse zeigen, dass das eINTACT-System den nativen Infektionsbedingungen nahe kommt und eine experimentelle Grundlage für die gezielte Gewinnung von Kernen von Effektor-Empfänger-Wirtszellen aus Xcc*AvrBs3-infizierten Blättern bietet (Abb. 1g – i).

Um die Funktionen des auf den Kern gerichteten Effektors XopD in Pflanzen zu untersuchen, inokulierten wir Blätter der eINTACT-Reporterlinie mit Xcc*AvrBs3, das XopD exprimiert, oder der entsprechenden xopD-Deletionsmutante Xcc∆xopD*AvrBs3. Bei fünf DPI begannen die mit Xcc∆xopD*AvrBs3 infizierten Blätter welke Läsionen zu zeigen, die im Spätstadium der Infektion (sieben DPI) zu dehydrierten und nekrotischen Symptomen führten; während mit Xcc*AvrBs3 infizierte Blätter gelbe, V-förmige Krankheitssymptome entwickelten, was darauf hindeutet, dass XopD die Krankheitssymptome verändert und die Bakterienvermehrung in den infizierten Blättern fördert (Abb. 2a). Daher haben wir mit unserem eINTACT-System Kerne, die entweder XopD (nuc+XopD) oder kein XopD (nuc−XopD) erhalten haben, von mit Xcc*AvrBs3 bzw. Xcc∆xopD*AvrBs3 infizierten Blättern bei fünf DPI gereinigt. Die Differenzialanalyse von nuc+XopD im Vergleich zu nuc−XopD lieferte somit die Grundlage für die Aufdeckung von XopD-ausgelösten Veränderungen in den Kernen von Effektor-Empfänger-Wirtszellen.

a: Repräsentative Arabidopsis-Blätter sind mit Xcc∆xopD*AvrBs3 (−XopD) und Xcc*AvrBs3 (+XopD) bei fünf und sieben DPI infiziert. b, Gen-Konzept-Netzwerk, das Verbindungen zwischen XopD-abhängigen DEGs und ihren signifikant (FDR < 0,05; fache Anreicherung > 2) angereicherten biologischen GO-Begriffen darstellt. Die DEGs, die nicht mit diesen GO-Begriffen versehen waren, wurden nicht angezeigt. c, WashU Epigenome Browser-Schnappschüsse, die mCG- und mCHH-Methylierungsniveaus an SUVH9- und OSCA1.1-Loci zeigen. Positive und negative Balken zeigen 5-Methylcytosin-Spiegel einzelner Cytosin auf den Watson-Strängen (+1) bzw. Crick-Strängen (−1) an. Die transponierbaren Elemente (TEs) werden als graue Kästchen angezeigt. Die Transkriptionsstartstelle (TSS) ist mit einem braunen Dreieck gekennzeichnet. d,e, Die Expressionsniveaus (mittlere Leseanzahl) von OSCA1.1 (d) und PR1, PR2, PR5, EDS1 und PAD4 (e) in nuc−XopD und nuc+XopD. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (Fehlerbalken) aus n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Die P-Werte von DESeq2 stammen aus dem Wald-Test, korrigiert um Mehrfachtests mit der Benjamini-Hochberg-Methode (nuc−XopD versus nuc+XopD; OSCA1.1, P = 0,033; PR1, P = 0,819; PR2, P = 0,947; PR5, P = 0,794; EDS1, P = 0,833; PAD4, P = 0,981). *P < 0,05; NS, nicht signifikant (P > 0,05). f, Relative Expression von XopD, PR1, PR2, OSCA1.1 und HYL1, nachdem XopD durch β-Östradiol in Arabidopsis-Sämlingen induziert wurde, relativ zu ihrer Expression in DMSO-behandelten Sämlingen. Der Ausdruck von TUB2 wird als Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwerte ± sed (Fehlerbalken) aus n = 2 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (DMSO-behandelte Sämlinge versus β-Östradiol-behandelte Sämlinge; XopD, P = 0,04; PR1, P = 0,04; PR2, P = 0,03; OSCA1,1, P = 0,42; HYL1, P = 0,15). *P < 0,05; NS, nicht signifikant (P > 0,05). Kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate (d–f).

Quelldaten

Der Vergleich der Kerntranskriptome in nuc+XopD mit nuc−XopD durch RNA-Sequenzierung identifizierte 924 differentiell exprimierte Gene (DEGs) (Ergänzungstabelle 1). Die Analyse der Genontologie (GO) ergab, dass diese DEGs erheblich an Transkripten angereichert waren, die an den Funktionen „Gen-Silencing“, „negative Regulierung der Genexpression“, „Gametophytenentwicklung“ und „tRNA-Aminoacylierung“ beteiligt sind (Abb. 2b und Ergänzungstabelle 2). Insbesondere ergab die GO-Analyse 13 DEGs, die wichtige Komponenten entweder der RNA-gesteuerten DNA-Methylierung oder kleiner RNA-Silencing-Pfade kodieren, von denen bekannt ist, dass sie die Gen-Silencing überwiegend über epigenetische Regulation bzw. RNA-Interferenz beeinflussen (Tabelle 1). Dies legt nahe, dass XopD-abhängige Veränderungen in der Genexpression des Wirts zumindest teilweise auf epigenetischer Ebene reguliert werden könnten.

Wir untersuchten daher XopD-abhängige Veränderungen in der genomweiten DNA-Methylierung von Cytosinen (mC) (Extended Data Abb. 3 und Ergänzungstabelle 3) und deren Korrelation mit Transkriptionsänderungen in nuc+XopD gegenüber nuc−XopD. Wir identifizierten 19 DEGs, die mit differentiell methylierten Regionen (DMRs) innerhalb ihrer 3-kb-proximalen Promotorregionen korrelierten (Ergänzungstabelle 4). Zu diesen 19 DEGs gehören beispielsweise SUVH9, das für eine Histon-Methyltransferase20 kodiert, und OSCA1.1, das für ein Ca2+-permeables Kanalprotein kodiert, das am osmotischen Stress-induzierten Stomatenverschluss bei Arabidopsis21 beteiligt ist. XopD verursachte verringerte mCG-Spiegel im SUVH9-Promotor und verringerte mCHH-Spiegel im OSCA1.1-Promotor (Abb. 2c). Da eine erhöhte Promotormethylierung normalerweise mit einer verringerten Transkription der nachgeschalteten Gene korreliert20, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass erhöhte SUVH9- und OSCA1.1-Transkriptspiegel (Tabelle 1 und Abb. 2d) wahrscheinlich die Folge einer XopD-induzierten Demethylierung ihrer Promotoren sind (Abb. 2c). ).

Eine frühere Studie zeigte, dass die Expression von XopD in Planta unter der Kontrolle eines β-Östradiol-induzierbaren Promotors eine SA-vermittelte Abwehrreaktion bei Arabidopsis auslöste11. Im Gegensatz dazu ergab unsere Untersuchung, die auf einem nativen Infektionsszenario basiert, bei dem der bakterielle Erreger Xcc XopD in Zielwirtszellen injiziert, keine Veränderungen in der Transkripthäufigkeit wichtiger SA-abhängiger Gene (Abb. 2e und Ergänzungstabelle 5). Die Diskrepanzen zwischen den beiden Studien beschränken sich nicht nur auf SA-bezogene Gene. Darüber hinaus fanden wir in unseren eINTACT-Daten keine Überlappung zwischen XopD-abhängigen DEGs und Genen, deren Transkriptniveaus sich veränderten, nachdem XopD durch β-Östradiol11 induziert wurde. Ein typisches Beispiel dafür ist, dass sowohl OSCA1.1 als auch HYL1, die XopD-abhängige Expressionsänderungen in Effektor-Empfängerzellen aufwiesen (Abb. 2d und Tabelle 1), ihre Expression nach der β-Östradiol-Induktion von XopD in Arabidopsis-Sämlingen nicht veränderten ( Abb. 2f).

Während der Infektion führt die durch Xcc*AvrBs3 T3SS vermittelte Abgabe zu Spurenmengen von XopD nur in Wirtszellen, auf die Bakterien abzielen4,13,14. Allerdings führt die durch β-Östradiol induzierte ektopische Expression zu hohen XopD-Spiegeln in allen Pflanzenzellen, was möglicherweise die Aktivität in der Pflanze verstärkt, was zu einer Fehlregulation der Genexpression und der Pflanzenphysiologie in einer Weise führt, die nicht einer natürlichen Infektion entspricht. Daher wurde zuvor gezeigt, dass die induzierte Expression von XopD in Arabidopsis lokalisierte nekrotische Flecken und Zelltod in Blättern verursachte, während native Bakterien XopD injizierten, um Blattnekrose zu unterdrücken (Abb. 2a). Diese beobachteten Diskrepanzen sprechen für die Notwendigkeit, Effektorfunktionen in einem Infektionssystem zu untersuchen, das den natürlichen Bedingungen möglichst nahe kommt.

Um zu klären, ob unsere effektor-empfängerzellspezifische Studie tatsächlich die Entdeckung von XopD-abhängigen Expressionsänderungen verbesserte, führten wir eine differenzielle Genexpressionsanalyse unter Verwendung von mit Xcc*AvrBs3 infizierten Ganzblattgeweben im Vergleich zu Xcc∆xopD*AvrBs3 als Ausgangsmaterialien durch (Erweiterte Daten). Abb. 4). Wir konnten keine Veränderungen der NRPD1A-, DDM1-, HYL1-, DWA1- und OSCA1.1-Transkriptspiegel in ganzen infizierten Blattgeweben beobachten (Extended Data Abb. 4); Obwohl einige dieser Änderungen ähnlichen Trends folgten wie die Vergleiche von nuc+XopD mit nuc−XopD (Tabelle 1), waren die Unterschiede viel kleiner und nicht signifikant (erweiterte Daten, Abb. 4). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass XopD-abhängige Expressionsänderungen, die in Effektor-Empfängerkernen aufgedeckt werden, bei der Analyse in masseninfizierten Blattgeweben auf nicht signifikante Werte verdünnt werden, was die Leistungsfähigkeit unseres eINTACT-Ansatzes demonstriert.

Da festgestellt wurde, dass OSCA1.1 einen XopD-abhängigen Anstieg der Expression aufweist (Abb. 2d), stellt sich die Frage nach der biologischen Relevanz der OSCA1.1-Induktion für die Xcc-Virulenz.

OSCA1.1 ist ein in der Plasmamembran lokalisiertes Ca2+-durchlässiges Kanalprotein, das in Arabidopsis als Osmosensor fungiert21. Mutationen in OSCA1.1 führen zu einem beeinträchtigten Ca2+-Anstieg und einem Versagen des Stomata-Verschlusses bei osmotischem Stress21. Um zu beurteilen, ob OSCA1.1 eine Rolle bei der Xcc-Infektion spielt oder nicht, haben wir osca1-1 erhalten, eine Nullmutante, die zwei Aminosäuresubstitutionen enthält, die zum Verlust der OSCA1.1-Funktion führen21 (Abb. 3a). Wir inokulierten die osca1-1-Pflanzen und Wildtyp-(Col-0)-Kontrollpflanzen mit Xcc*, das XopD exprimiert. Wir beobachteten, dass die infizierten osca1-1-Blätter im Vergleich zu den infizierten Col-0-Kontrollen einen deutlich geringeren Grad an V-förmigen Chlorose-Krankheitssymptomen aufwiesen und eine geringere Bakterienpopulation aufwiesen (Abb. 3b, c und erweiterte Daten Abb. 5). Im Spätstadium der Infektion (neun DPI) zeigten infizierte osca1-1-Blätter Gewebewelke und Nekrose, im Gegensatz zu chlorotischen Krankheitssymptomen in den infizierten Col-0-Blättern (Abb. 3d). Zusätzlich inokulierten wir Xcc*-Bakterien in die Blätter einer zuvor etablierten transgenen Linie, die OSCA1.1 unter der Kontrolle eines 35S-Promotors im osca1-1-Mutantenhintergrund (Pro35S:OSCA1.1/osca1-1) exprimierte, wo die konstitutive Expression von OSCA1.1 ergänzt die beeinträchtigte osmotische Ca2+-Signalübertragung in der osca1-1-Mutante als Reaktion auf osmotischen Stress21. Wir beobachteten, dass der Grad der Krankheitssymptome und die Menge der Bakterienpopulation in infizierten Pro35S:OSCA1.1/osca1-1-Blättern im Vergleich zu den infizierten osca1-1-Blättern signifikant höher waren, im Vergleich zu den infizierten Col-0-Kontrollen jedoch immer noch niedriger (Erweiterte Daten Abb. 6). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass OSCA1.1 für bakterielle Erkrankungen und die XopD-abhängige Unterdrückung von Blattnekrose wichtig ist und dass eine transkriptionelle Aktivierung von OSCA1.1 in auf bakterielle Effektoren gerichteten Zellen für eine optimale Wirtsanfälligkeit erforderlich sein kann.

a, Genmodell von OSCA1.1, das die Positionen der beiden Aminosäuresubstitutionen in der osca1-1-Mutante zeigt. b, Ein Boxplot, der die Krankheitsindexwerte (0, keine Symptome; 0,5 bis 1,5, schwache Chlorose; 2 bis 3, starke Chlorose) von jeweils n = 40 mit Xcc* infizierten osca1-1- oder Col-0-Blättern von acht einzelnen Pflanzen darstellt , bei sieben DPI. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (osca1-1 versus Col-0, P = 1,72e-5). ***P < 0,001. c, Ein Boxplot, der die Bakterienpopulationsdichte in n = 23 osca1-1- oder n = 24 mit Xcc* infizierten Col-0-Blättern von acht verschiedenen Pflanzen bei sieben DPI darstellt. KBE, koloniebildende Einheiten. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (osca1-1 versus Col-0, P = 0,0013). **P < 0,01. d, Vertreter Xcc* inokulierte Blätter mit osca1-1 und Col-0 bei neun DPI. e, Relativer Ausdruck von OSCA1.1 in Col-0 hinterlässt eine Infiltration mit Xcc∆xopD*dTALE#1 (dTALE#1) und Xcc∆xopD*dTALE#2 (dTALE#2), relativ zu seinem Ausdruck in Xcc∆xopD* vec2 (Vektor) infiltrierte Blätter mit einer DPI. Der Ausdruck von TUB2 wird als Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (Fehlerbalken) aus n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Kleine Kreise, Datenpunkte einzelner biologischer Replikate. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (dTALE#1 gegenüber Vektor, P = 0,021; dTALE#2 gegenüber Vektor, P = 0,045). *P < 0,05. f,g, Mikroskopiebilder der epidermalen Pflasterzellen und Schließzellen, die OSCA1.1-GFP an der Plasmamembran in Xcc∆xopD*vec2 (Vektor) (f) und Xcc∆xopD*dTALE#1 (dTALE#1) exprimieren ( g) inokulierte Blätter der transgenen ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP-Linie bei fünf DPI. Die Effektor-Empfängerzellen sind durch weiße Dreiecke gekennzeichnet. Die Experimente wurden zweimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. h, Ein Boxplot, der die Bakterienpopulationsdichte in Col-0-Blättern darstellt, die mit Xcc∆xopD* (−XopD)- und Xcc* (+XopD)-Stämmen inokuliert wurden, die einen leeren Vektor (Vektor), dTALE#1 oder dTALE#2, bei sieben DPI liefern . Für jeden Bakterienstamm wurden n = 12 infizierte Blätter von vier Einzelpflanzen untersucht. Unterschiede zwischen den Bakterienpopulationen aller Bakterienstämme waren nicht signifikant (einseitiger ANOVA-Test). i, repräsentative Blätter, die in (h) verwendet werden. Auf den Boxplots (b,c,h) zeigen horizontale Linien von oben Maxima-, obere Quartil-, Median-, untere Quartil- und Minimawerte; Kreuzmarkierungen zeigen die Mittelwerte an; und kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate.

Quelldaten

Um zu untersuchen, ob die Virulenzfunktion von Wir transformierten die Plasmide, die diese dTALEs kodieren, in die xopD-Deletionsmutante Xcc∆xopD* und infizierten entsprechende Transformanten (Xcc∆xopD*dTALE#1 und GFP unter der Kontrolle des OSCA1.1-Promotors (ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP). Reverse Transkription-quantitative Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) und Immunblotting bestätigten erhöhte Werte an OSCA1.1-Transkripten (Abb. 3e) bzw. OSCA1.1-GFP (Extended Data Abb. 7b, c), was auf eine dTALE-abhängige Expression hinweist Aktivierung von OSCA1.1 in Effektor-Zielzellen. Darüber hinaus ergab die mikroskopische Untersuchung ein stark induziertes OSCA1.1-GFP an der Plasmamembran epidermaler Pflasterzellen und angrenzender Schutzzellen, was darauf hindeutet, dass diese Zellen bakterielle Effektoren erhielten (Abb. 3f, g). Allerdings erhöhte die dTALE-induzierte Überexpression von OSCA1.1 weder die Anfälligkeit des Wirts gegenüber Xcc∆xopD* noch gegenüber . 3i). Dies weist darauf hin, dass sowohl die transkriptionelle als auch die translatorische Hochregulierung der OSCA1.1-Aktivitäten für die XopD-vermittelte bakterielle Pathogenese notwendig, aber nicht ausreichend sind.

Was könnten die noch unbekannten wirtsanfälligen Faktoren sein, die zusammen mit OSCA1.1 bei der XopD-vermittelten bakteriellen Virulenz wirken? Unsere eINTACT-Daten deckten auch viele DEGs auf, die an der Regulierung der Abscisinsäure (ABA)-Reaktionen von Arabidopsis beteiligt sind (Abb. 4a). Zu den XopD-induzierten Genen gehörte beispielsweise MYB124, das einen MYB-TF kodiert, der für die Stomata-Entwicklung und den ABA-vermittelten Stomata-Verschluss erforderlich ist22; AIB kodiert für einen bHLH-TF, der die Transkription von ABA-responsiven Genen aktiviert23; und ABI8 und GOLS2 kodieren beide positive Regulatoren von ABA-Antworten24,25. Bemerkenswert ist, dass das Haupt-ABA-responsive Gen RD29A26 einen etwa vierfachen Anstieg der Transkriptmengen in nuc+XopD aufwies (Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass XopD die ABA-Reaktion verstärkt. Allerdings war die Expressionsänderung von RD29A in unseren RNA-Sequenzierungsdaten (RNA-seq) nach Korrektur für mehrere Tests statistisch nicht signifikant (Abb. 4a). Da wir nicht ausschließen können, dass unsere RNA-seq-Methode mit extrem geringem Input, die eine zweistufige cDNA-Amplifikation beinhaltet, die Variabilität zwischen biologischen Replikaten erhöhen könnte, haben wir RD29A-Transkripte in nuc+XopD im Vergleich zu nuc−XopD durch RT-qPCR quantifiziert (Abb . 4b). Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten tatsächlich einen signifikanten Anstieg der RD29A-Transkripte (Abb. 4b) und bestätigten frühere Ergebnisse unserer RNA-seq-Analyse (Abb. 4a) und demonstrierten damit die Reproduzierbarkeit der eINTACT-Methode.

a, Die Expressionsniveaus (mittlere Lesezahlen) von ABA-responsiven Genen in nuc−XopD und nuc+XopD. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (Fehlerbalken) aus n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. DESeq2 P-Werte stammen aus Wald-Tests, die mit der Benjamini-Hochberg-Methode um Mehrfachtests korrigiert wurden (nuc−XopD versus nuc+XopD; RD29A, P = 0,216; MYB33, P = 0,011; ABI8, P = 0,048; AIB, P = 0,046; GOLS2, P = 0,000; MYB124, P = 0,024; CIPK15, P = 0,033; CBL9, P = 0,035). *P < 0,05, ***P < 0,001, NS, nicht signifikant (P > 0,05). b: RT-qPCR-Analyse der RD29A-Expression in nuc+XopD relativ zu ihrer Expression in nuc-XopD. Der Ausdruck von TUB2 wird als Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (Fehlerbalken) aus n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (P = 0,043). *P < 0,05. c, Relative Häufigkeit von miR159a in nuc-XopD und nuc+XopD im Vergleich zu seiner Häufigkeit in den gesamten Kernen scheininokulierter Blätter. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (Fehlerbalken) aus n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt und gegen die Häufigkeit von ACTIN2/8 in jeder Probe normalisiert. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (nuc−XopD versus nuc+XopD, P = 0,019). *P < 0,05. d, Repräsentative Blätter, infiziert mit den angegebenen Bakterienstämmen unter normalen (60 %) oder hohen (95 %) Luftfeuchtigkeitsbedingungen bei sieben DPI. Mock, Behandlung mit Puffer; ABA, Behandlung mit ABA. e, Die Wasserverlustrate von abgelösten, mit Xcc* (+XopD) und Xcc∆xopD* (−XopD) infizierten Blättern bei sieben DPI. Die Daten werden als Mittelwerte ± sd (Fehlerbalken) von n = 8 Blättern von vier verschiedenen Pflanzen dargestellt. f, Ein Boxplot, der die Bakterienpopulationsdichte in symptomatischen Blattgeweben darstellt, die mit Xcc* (+XopD) und Xcc∆xopD* (−XopD) bei sieben DPI inokuliert wurden. Horizontale Linien von oben zeigen Maxima-, obere Quartil-, Median-, untere Quartil- und Minimawerte und Kreuzmarkierungen zeigen die Mittelwerte. Für jede Behandlung wurden n = 8 Blätter von vier verschiedenen Pflanzen untersucht. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (keine Behandlung: mit Xcc∆xopD* inokulierte Blätter vs. . *P < 0,05. Kleine Kreise (a–c,f) stellen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate dar.

Quelldaten

Wir fanden in nuc+XopD nicht nur eine erhöhte Expression der positiven Regulatoren der ABA-Reaktionen, sondern umgekehrt auch eine verminderte Expression mehrerer Gene, die negative Regulatoren der ABA-Signalübertragung kodieren, zum Beispiel CIPK15 und CBL9, die beide als Ca2+-Sensoren fungieren, die ABA negativ modulieren Empfindlichkeit und Biosynthese27,28. Sowohl cipk15- als auch cbl9-Mutantenpflanzen reagieren überempfindlich auf ABA und zeigen eine erhöhte Expression ABA-responsiver Gene und einen verstärkten Stomatenverschluss27,28. In ähnlicher Weise wurde die verringerte Expression in nuc+XopD für die kleinen RNA-Prozessoren DWA1 und HYL gefunden (Tabelle 1), die beide eine negative Rolle bei der Regulierung der ABA-Signalübertragung spielen29,30. Die exogene ABA-Anwendung induziert eine Hyperexpression von ABA-responsiven Genen in dwa1-Mutantenpflanzen30 und HYL1 unterdrückt das ABA-induzierbare Gen MYB33 über miR159a-vermittelte Gen-Stummschaltung29,31,32. Um den Effekt der herunterregulierten HYL1-Expression in nuc+XopD zu untersuchen, haben wir die miR159a-Häufigkeit in nuc−XopD und nuc+XopD durch Stammschleifen-RT-qPCR quantifiziert. Wir fanden heraus, dass die Häufigkeit von miR159a in nuc+XopD deutlich (>sechsfach) geringer war (Abb. 4c), was mit einem signifikanten Anstieg der MYB33-Expression in diesen Kernen zusammenfiel (Abb. 4a).

Die oben genannten Daten deuten darauf hin, dass XopD die Expression sowohl positiver als auch negativer Regulatoren der ABA-Signalübertragung manipuliert, was mit einem Arbeitsmodell übereinstimmt, bei dem XopD ABA-Reaktionen in Effektor-Empfänger-Wirtszellen induziert. Darüber hinaus haben wir mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) keinen signifikanten Unterschied in den ABA-Spiegeln zwischen mit Xcc*AvrBs3 und Erhöhung des ABA-Gehalts.

Es ist bemerkenswert, dass ABA den Stomataverschluss induziert, um Wasserverlust als Reaktion auf Trockenstress zu verhindern33. Daher könnte die Manipulation der ABA-Signalübertragung durch XopD einen Stomatenverschluss induzieren, was zu einer erhöhten Wasserverfügbarkeit im Apoplasten führt, um das Bakterienwachstum zu fördern. Zur Untermauerung dieser Hypothese zeigten mikroskopische Untersuchungen, dass epidermale Pflasterzellen und angrenzende Schutzzellen, die an der Regulierung des Stomatenverschlusses22 beteiligt sind, beide Effektoren erhielten (Abb. 1d–f, 3g). Darüber hinaus reichte eine exogene ABA-Anwendung oder eine hohe Luftfeuchtigkeit (95 %) aus, um das Welken der Blätter und die frühe Nekrose zu unterdrücken, die durch eine Xcc∆xopD*-Infektion hervorgerufen werden (Abb. 4d). Schließlich hemmte XopD den Wasserverlust in abgelösten, mit Xcc* infizierten Blättern (Abb. 4e), was die Annahme stützt, dass XopD den Stomatenverschluss induziert. In diesem Zusammenhang ist zu bedenken, dass OSCA1.1 für den Stomatenverschluss bei osmotischem Stress21 und für die XopD-abhängige Unterdrückung der Blattnekrose von entscheidender Bedeutung ist (Abb. 3d). Daher wurden die Welke- und nekrotischen Symptome sowie die geringe bakterielle Infektion in osca1-1-Blättern (Abb. 3b – d) höchstwahrscheinlich durch das Versäumnis verursacht, die Spaltöffnungen zu schließen, was zu einer Dehydrierung des infizierten Gewebes führte, das das Bakterienwachstum nicht unterstützt.

Nachdem Xcc-Bakterien über Wunden oder Hydathoden in die Blätter eingedrungen sind, dringen sie schnell in die Xylemgefäße ein, was zu systemischen Gefäßinfektionen führt und schließlich einen nekrotrophen Lebensstil annimmt. Dies führt zur Verdauung des Gefäßgewebes und zur Kolonisierung des Mesophyll-Apoplasten, was zur Entstehung der Schwarzfäule führt2. Angesichts der Tatsache, dass XopD das Bakterienwachstum nicht auf der Ebene des gesamten Blattes fördert (Extended Data Abb. 9), aber Welke und nekrotische Symptome in den späten Stadien der Infektion unterdrückt, nehmen wir an, dass XopD den Stomataverschluss auf räumlich-zeitlich kontrollierte Weise induziert, um zuzunehmen Wasserspiegel im Apoplasten, nachdem sich Xcc aus den Xylemgefäßen der Pflanze in den Mesophyll-Apoplasten in symptomatischen Geweben ausgebreitet hat. Der Abbau der Xylemgefäße führt zu einem starken Wassermangel in den Blättern, und dementsprechend hemmt der XopD-vermittelte Stomataverschluss die Dehydrierung des apoplastischen Raums. Wir schlagen vor, dass die räumlich-zeitlich regulierte Aktivität von XopD eine längere Bakterienproliferation während der nekrotrophen Phase der Infektion erleichtert (Abb. 4f, 5).

Im Spätstadium der Infektion durchbrechen Xcc-Bakterien (violette Stäbchen) die Xylemgefäße der Pflanze und dringen in den Mesophyll-Apoplastenraum in symptomatischen Geweben ein, wo sie Zugang zu den Zellen erhalten, die mit dem Apoplasten und dem Symplasten verbunden sind, wie etwa Mesophyllzellen. epidermale Pflasterzellen und ihre benachbarten Schutzzellen und liefern Effektoren in diese Zellen. In den XopD-Empfängerzellen (rot) fördert XopD die Expression von ABA-responsiven Genen (z. B. RD29A), möglicherweise durch die Steuerung von Funktionen von DELLA-interagierenden TFs über seine SUMO-Proteaseaktivität, und aktiviert die OSCA1.1-Expression, die mit der Demethylierung des korreliert OSCA1.1-Promotor. Die XopD-abhängige Förderung der ABA-Vereinzelung und des OSCA1.1-vermittelten Ca2+-Anstiegs induziert einen stabilen Stomatenverschluss zur Bildung eines wässrigen apoplastischen Raums, der das Bakterienwachstum unterstützt. Blaue Pfeile zeigen interzelluläre Signale wie Ca2+, miRNAs und Hormone an. Der vorgeschlagene XopD-DELLA-TF-Komplex ist grau schattiert.

Unsere Studie deckt einen bisher unbekannten Mechanismus auf, bei dem das auf den Kern gerichtete Xanthomonas-Effektorprotein XopD den OSCA1.1/ABA-vermittelten stomatären Verschluss des Wirts manipuliert, um einen feuchten Lebensraum zu schaffen, der die Bakterienvermehrung begünstigt. Insbesondere zeigen wir, dass OSCA1.1 für die krankheitsfördernde Funktion von XopD bei der Unterdrückung des Welkens und der frühen Nekrose in infizierten Blättern notwendig ist und dass für eine optimale Wirtsanfälligkeit eine XopD-abhängige Erhöhung der OSCA1.1-Expression erforderlich sein kann. Die vorherige Studie legte nahe, dass OSCA1.1 möglicherweise vor der ABA-Signalisierung wirkt, da der durch die exogene Anwendung von ABA induzierte Stomata-Verschluss bei der osca1-1-Mutante nicht beeinträchtigt wurde21. Die durch OSCA1.1 als Reaktion auf osmotischen Stress aktivierten Downstream-Komponenten sind jedoch weiterhin unbekannt. Interessanterweise deuten neuere Arbeiten zu durch osmotischen Stress aktivierten Signalwegen darauf hin, dass die Ca2+-Erhöhung beim ABA-vermittelten Stomata-Verschluss zwar nicht unbedingt erforderlich ist, der erhöhte Ca2+-Wert jedoch schnellere und gleichmäßigere Verschlüsse ermöglicht33. Eine mögliche Erklärung ist daher, dass ein XopD-abhängiger Anstieg der OSCA1.1-Transkription die OSCA1.1-Ca2+-Kanalaktivitäten in Effektor-Empfänger-Wirtszellen hochregulieren könnte, was zu erhöhten Ca2+-Spiegeln führt, die den ABA-vermittelten Stomatenverschluss beschleunigen und stabilisieren (Abb. 5). ).

Interessanterweise zeigten frühere Studien zu den Ca2+-durchlässigen Kanälen OSCA1.3 und OSCA1.7 von Arabidopsis deren funktionelle Relevanz für die Regulierung des Stomatenverschlusses zur Verhinderung des Eindringens von P. syringae34. Insbesondere ist OSCA1.1 ein hyperosmolalitätsgesteuerter mechanosensitiver Kanal, der als Reaktion auf osmotischen Stress ausgelöst wird, um Wasserverlust zu verhindern21, und die durch eine XccΔxopD*-Infektion verursachte Blattdehydrierung stellt möglicherweise die Hyperosmolalitäts-basierten Gating-Komponenten für den XopD-abhängigen Anstieg des OSCA1.1-Ca2+-Kanals bereit Aktivität. Im Gegensatz dazu wird die Ca2+-permeable Kanalaktivität von OSCA1.3 und OSCA1.7 durch Phosphorylierung durch die Immunrezeptorkinase BIK1 bei der Wahrnehmung des Krankheitserregers aktiviert34. Dies legt nahe, dass zusätzliche Regulationsmechanismen wie posttranslationale Modifikationen zur Regulierung der Aktivitäten pflanzlicher Ca2+-Kanäle als Reaktion auf bestimmte Reize beitragen. Darüber hinaus ist Xcc im Gegensatz zu P. syringae, einem Mesophyllpathogen, das über die Spaltöffnungen in die Pflanze gelangt1, ein Gefäßpathogen, das über Hydathoden2 in die Pflanze gelangt. Daher könnte der durch verschiedene Ca2+-durchlässige Kanäle vermittelte Stomatenverschluss als differenzielle Drehscheibe der Immunität gegen Mesophyll-Krankheitserreger im Vergleich zur Krankheitsförderung vaskulärer Krankheitserreger dienen.

Wir betonen die Leistungsfähigkeit genomweiter Studien zum Transkriptom und Epigenom in Effektor-Empfängerzellen und entdecken 924 XopD-regulierte Gene, die an verschiedenen Mechanismen beteiligt sind, beispielsweise Gen-Silencing, negativer Regulierung der Genexpression, Gametophyten-Entwicklung und tRNA-Aminoacylierung (Abb. 2b und Ergänzungstabelle 2), von denen einige mit DNA-Methylierungsänderungen in ihren Promotoren korrelieren, beispielsweise SUVH9 (Abb. 2c). Obwohl wir uns in dieser Studie auf die Untersuchung der Funktion von XopD bei der Transkriptionsregulation der osmotischen Signalübertragung konzentrieren, wäre es für zukünftige Studien interessant zu charakterisieren, wie andere bisher unbekannte Mechanismen gemeinsam zu den In-planta-Funktionen von XopD beitragen könnten.

In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten10 konnten wir keinen nennenswerten Unterschied in der Transkription von DELLA-abhängigen GA-responsiven Genen zwischen nuc-XopD und nuc+XopD beobachten, obwohl XopD physikalisch mit DELLA-Proteinen interagiert, von denen allgemein bekannt ist, dass sie negative Regulatoren von sind GA-Signalisierung10. Es ist erwähnenswert, dass DELLA-Proteine ​​in manchen Zusammenhängen als positive Regulatoren der ABA-Signalübertragung fungieren35. Beispielsweise rekrutiert DELLA direkt ABI3- und ABI5-TFs, um ABA-responsive Gene während der Samenkeimung zu aktivieren35, während die Sumoylierung von ABI5 seine DNA-Bindungsfähigkeit abschwächt36. Wir fanden heraus, dass ein ABI5-abhängiges ABA-responsives Gen, RD29A36, in unserer Transkriptomanalyse eine erhöhte Expression in nuc + seine SUMO-Proteaseaktivität zur Aktivierung von ABA-Reaktionen (Abb. 5). In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass ein XopD-Homolog, XopDXe aus dem X. euvesicatoria-Stamm 85-10 (Xe85-10), den auf Tomatenethylen reagierenden Transkriptionsfaktor SlERF4 deSUMOyliert und destabilisiert, um Ethylen-vermittelte Abwehrreaktionen zu unterdrücken37. Die Analyse der Proteinstruktur zeigt, dass XopDXe eine N-terminale Verlängerungssequenz und eine mutmaßliche DNA-bindende Helix-Loop-Helix-Domäne enthält, die in XopD9 fehlen (Erweiterte Daten, Abb. 1). Darüber hinaus ist XopD nicht in der Lage, die Xe85-10ΔxopDXe-Mutante9 zu ergänzen, was auf unterschiedliche Funktionen von XopD und XopDXe schließen lässt.

Abschließend haben wir ein neues Konzept zur Gewinnung von Kernen von Effektor-Empfänger-Wirtszellen aus infizierten Blattgeweben entwickelt und gezeigt, dass das eINTACT-System es uns ermöglicht, effektorabhängige transkriptionelle und epigenetische Veränderungen des Wirts aufzudecken, die bei großinfizierten Blattgeweben nicht nachweisbar waren als Lernmaterialien verwendet. Darüber hinaus ist eINTACT in einzigartiger Weise dazu geeignet, Funktionen von Effektoren in Planta aufzudecken, die dosisabhängigen, räumlich-zeitlichen und zelltypspezifischen Richtlinien unterliegen. Derzeit wird Einzelzell-RNA-Seq zunehmend zur Messung der Genexpressionsniveaus in einzelnen Zelltypen in Pflanzen verwendet38. Eine bakterielle Infektion führt jedoch zu Veränderungen des Zellturgors, der Zellwandintegrität und der Zellgröße, die sich unweigerlich auf Zellisolations- und Sortierprozesse auswirken und die Verwendung von Einzelzell-RNA-Seq in Studien zur Pflanzenpathologie einschränken38. Somit stellt eINTACT eine einzigartige, kostengünstige und praktische Methode zur Isolierung hochwertiger Kerne in bakteriellen Effektor-zielgerichteten Wirtszellen für nachfolgende transkriptomische und epigenomische Analysen ohne spezielle und teure Ausrüstung dar. In dieser Studie nutzten wir die Xcc-vermittelte Abgabe von AvrBs3, um den eINTACT-Reporter in Arabidopsis-Zellen zu aktivieren, um den Xcc-Effektor XopD zu untersuchen. Es ist auch möglich, AvrBs3 auf andere Bakterienarten zu übertragen, beispielsweise auf den weit verbreiteten Modellpathogen P. syringae . Daher gehen wir davon aus, dass das neu etablierte eINTACT-System eine Grundlage für die genaue Aufklärung der Funktion von Effektoren zahlreicher gramnegativer Pflanzenbakterien in nativen Infektionskontexten in Planta bieten wird.

Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt. Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Bakterienstämme sind in der Ergänzungstabelle 7 zusammengefasst. Alle Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Als Wildtyppflanze wurde in dieser Arbeit die Arabidopsis thaliana-Akzession Col-0 verwendet. Die homozygoten Samen der transgenen ProXVE:XopD-Linie Nr. 38, die XopD unter der Kontrolle eines β-Östradiol-induzierbaren Promotors exprimieren, die osca1-1-Mutante, die Linien ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP und Pro35S:OSCA1.1/osca1-1 wurden in früheren Studien etabliert11,21.

Vor der Aussaat wurden die Samen drei Tage lang bei 4 °C in 0,1 % Agar geschichtet. Zur Erzeugung der transgenen Linie und zur Behandlung mit β-Östradiol wurden Pflanzen auf Erde oder Agarplatten, die 1/2 Murashige- und Skoog-Medium (MS), 0,8 % Agar und die entsprechenden Antibiotika enthielten, in Wachstumskammern unter Langtagbedingungen gezüchtet (16). h Licht und 8 h Dunkelheit) bei 22 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 %.

Für Infektionstests wurden Pflanzen fünf Wochen lang in Wachstumskammern unter Kurztagbedingungen (8 Stunden Licht und 16 Stunden Dunkelheit) bei 22 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 % auf Erde gezüchtet. Zwei Tage vor der Infektion wurden die Pflanzen in eine Kurztag-Wachstumskammer bei 25 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % überführt, was den oberen Temperatur- und Feuchtigkeitsgrenzen für ein optimales Arabidopsis-Wachstum entspricht39. Die wärmere und höhere relative Luftfeuchtigkeit begünstigt eine Xcc-Infektion und fördert die um zwei Tage frühere Symptomentwicklung. Die infizierten Pflanzen wurden in der Kurztagkammer bei 25 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % oder 95 % gehalten. Die Lichtverhältnisse wurden durch eine Mischung aus Kaltweiß- und Gro-Lux-Breitspektrum-Fluoreszenzlichtern mit einer Fluenzrate von 125 bis 175 μmol m−2 s−1 erzeugt.

Zur Herstellung des ProBs3:RedNTF:tNOS-Konstrukts (bezeichnet als pYY1704) wurde ein Gateway-kompatibles Eintrittsplasmid, das die 344 Basenpaare (bp) lange Promotorsequenz des Pepper-Bs3-Gens18 trägt, in einen pGREEN-IIS-basierten Zielvektor kloniert, der das enthält attR1-attR2 Gateway-Rekombinationskassette (pFK-386). Für Gateway-Reaktionen wurde ein Gateway-LR-Clonase-II-Enzymmix (Invitrogen) verwendet. Anschließend wurde nach der attR1-attR2-Kassette durch Sticky-End-Klonierung unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI ein Nopalin-Synthase-Terminator kloniert. Schließlich wurde das DNA-Fragment des NTF-Proteins aus dem Plasmid pYY120416 durch Sticky-End-Klonierung unter Verwendung des Restriktionsenzyms EcoRI zwischen den Bs3-Promotor und den Nopalin-Synthase-Terminator platziert.

Das Pro35S:RedNTF:rbcs-Konstrukt (bezeichnet als pYY1705) wurde durch Gateway-Rekombination des Eintrittsplasmids pYY120416 und eines pGREEN-IIS-basierten Zielvektors erzeugt, der den 35S-Promotor an der Vorderseite der attR1-attR2-Gateway-Rekombinationskassette (pFK-209) beherbergt. .

Zur Erzeugung der eINTACT-Reporterlinie und der Pro35S-INTACT-Reporterlinien wurden pYY1704 und pYY1705 in homozygote ProUBQ10:BirA-Linien16 transformiert, wobei der Agrobacterium tumefaciens-Stamm ASE und die Floral-Dip-Methode40 zum Einsatz kamen. Homozygote Linien wurden auf 1/2 MS-Agarplatten, die 50 μg ml–1 Kanamycin enthielten, selektiert.

Die beiden 18 bp langen TAL-Effektorbindungselemente (EBEs), denen Thymin (T) vorangestellt ist, wurden etwa 50 bp stromaufwärts der OSCA1.1-Transkriptionsstartstelle (TSS) identifiziert. Ihre Nukleotidsequenzen sind: EBE#1, TCTTGTGTGTTTCTCGCGT; EBE#2, TACTTCATTCATCACTGCT. Um die dTALEs zu klonen, die auf diese EBEs abzielen, wurde ein DNA-Fragment, das für die N-terminale (290 aa) und C-terminale Region (281 aa) von AvrBs3 kodiert und von BsaI-Restriktionsenzymstellen flankiert ist, durch PCR amplifiziert und anschließend in ein pENTR CACC-AAGG kloniert Plasmidvektor41, was pENTR TALE N/C ergibt. Anschließend wurde das TALE-BamHI-Fragment im pSKX1-ArtTAL-Vektor42 durch das AvrBs3 N/C-Fragment aus pENTR TALE N/C unter Verwendung des BamHI-Restriktionsenzyms ersetzt, was pSKX1-TALE N/C ergab. Die sich wiederholenden variablen Direste von dTALEs, die auf die beiden EBEs dTALE#1, HD-NG-NG-NH-NG-NH-NG-NH-NG-NG-NG-HD-NG-HD-NH-HD-NH-NG, abzielen ; dTALE#2, NI-HD-NG-NG-HD-NI-NG-NG-HD-NI-NG-HD-NI-HD-NG-NH-HD-NG, wurden durch modularen Zusammenbau erstellt und schließlich in pSKX1 geklont -TALE N/C unter Verwendung des BpiI-Restriktionsenzyms43, was pSKX1-dTALE#1 und pSKX1-dTALE#2 ergibt.

Um den Mutantenstamm 8004∆avrAC∆xopAM∆xopD (Xcc∆xopD*) zu erzeugen, wurde die xopD-Deletion in die Xcc-Doppeldeletionsmutante 8004∆avrAC∆xopAM (Xcc*) unter Verwendung des SacB-Systems mit einem modifizierten pK18-Suizidvektor19 eingeführt und durch verifiziert PCR. Um Xcc*AvrBs3 (8004∆avrAC∆xopAM pDS300F) und bzw. durch triparentale Paarung19. Xcc*vec1 und Xcc*vec2 wurden durch Transformation von Xcc* mit einem leeren pDSK- und pSKX1-Plasmid durch Elektroporation hergestellt. Um Bakterienstämme zu erzeugen, die dTALE liefern, wurden Xcc* oder Xcc∆xopD* mit pSKX1-dTALE#1 und pSKX1-dTALE#2 durch Elektroporation transformiert, was Xcc*dTALE#1, #1, Xcc∆xopD*dTALE#2. Alle Xcc-Stämme wurden auf Nährhefe-Glycerin-Agarplatten bei 28 °C gezüchtet und die Antibiotikaselektion wurde unter Verwendung der folgenden Konzentrationen (in µg ml−1) durchgeführt: Rifampicin, 50; Spectinomycin, 40; Gentamycin, 15.

Bei Verwendung der Wundinokulationsmethode wurden vollständig ausgebreitete Blätter von fünf Wochen alten Pflanzen mit bakteriellem Inokulum (108 KBE ml−1, OD: 0,1 in 1 mM MgCl2) inokuliert, indem die zentrale Blattader dreimal mit einer Nadel durchstochen wurde das in bakterielles Inokulum getaucht wurde19. Mit 1 mM MgCl2 inokulierte Pflanzen wurden als scheininokulierte Kontrolle verwendet. Bei Verwendung der Infiltrationsmethode wurden die abaxialen Blattseiten mit einer stumpfen Spritze mit bakteriellem Inokulum infiltriert.

Nach der Inokulation wurden die Pflanzenschalen mit durchsichtigen Plastikdeckeln abgedeckt und versiegelt, um 24 Stunden lang eine relative Luftfeuchtigkeit von nahezu 100 % aufrechtzuerhalten. Bei einem DPI wurden die Abdeckungen entfernt, um die infizierten Pflanzen bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % zu halten. Um die infizierten Pflanzen bei einer hohen relativen Luftfeuchtigkeit (95 %) zu halten, wurden in einigen Experimenten die Abdeckungen leicht geöffnet. Zur Überwachung der Luftfeuchtigkeit in den Schalen kam ein mobiler Feuchtigkeitsmesser zum Einsatz.

Für die gesamte Bildgebung in dieser Arbeit wurde ein LEICA DMI3000 B-Bildgebungssystem unter Verwendung von Hellfeld-, 4′,6-Diamidino-2-phenylindol- (DAPI), mCherry- und GFP-Filtern verwendet.

Drei Sätze Blattproben wurden unabhängig voneinander geerntet und verarbeitet. Für jeden Satz wurden etwa 650 Blätter von eINTACT-Reporterpflanzen mit Xcc*AvrBs3 oder Xcc ∆xopD*AvrBs3 unter Verwendung der Verwundungsmethode inokuliert. Die inokulierten Blätter wurden bei fünf DPI gesammelt und sofort in 50-ml-Falcon-Röhrchen, suspendiert in flüssigem Stickstoff, eingefroren. Die Proben wurden vor der INTACT-Reinigung bei –80 ° C gelagert. Die INTACT-Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt16,17. Die Reinheit und Ausbeute der Kerne wurden mikroskopisch beurteilt. Aus jeder Blattprobe wurden etwa 2,5 × 105 Kerne gewonnen und in 1 × 105 zur Herstellung einer RNA-seq-Bibliothek, 1 × 105 zur Stammschleifen-qPCR-Analyse von miRNAs und 5 × 104 zur Herstellung einer enzymatischen Methylsequenzierungsbibliothek aufgeteilt . Kernproben wurden vor weiteren Experimenten bei –80 °C gelagert.

Zur Validierung des eINTACT-Systems wurden Gesamtkerne aus Blättern der eINTACT-Reporterlinie, die mit Xcc*vec1 oder Effektor-Empfängerkerne wurden durch INTACT aus Xcc*AvrBs3-infizierten Blättern gereinigt. Als Kontrolle wurden die Gesamtkerne aus Blättern der Pro35S-INTACT-Reporterlinie verwendet. Kernproteinproben wurden hergestellt, indem Gesamtkerne und etwa 10.000 INTACT-gereinigte Kerne mit 1 × SDS-Puffer gemischt, durch 5-minütiges Kochen bei 95 ° C denaturiert und durch Western Blot analysiert wurden. Das biotinylierte NTF-Protein (∼42 kDa) wurde mit alkalischer Streptavidin-Phosphatase (Promega) nachgewiesen und Signale wurden durch eine Farbreaktion unter Verwendung einer NBT-BCIP-Lösung (Roche) entwickelt. Die Menge an H3-Protein (∼15 kDa) wurde als interne Kontrolle der Anzahl der Kerne in jeder Probe unter Verwendung eines Anti-H3-Antikörpers (Millipore, Katalog-Nr. 17-10254) in einer Verdünnung von 1:1.000 und eines Anti-H3-Antikörpers gemessen. Kaninchen-Sekundärantikörper (IRdye680/LI-COR, Katalog-Nr. 925-68073) in einer Verdünnung von 1:10.000. Das konjugierte Fluorophorsignal wurde mit einem Amersham Typhoon-Scanner (GE Healthcare Life Sciences) unter Verwendung eines BPFR 700-Filters bei 680 nm sichtbar gemacht.

Um die durch von Bakterien übertragene dTALEs induzierte Überexpression von OSCA1.1-GFP zu untersuchen, wurden die mit Bakterien infiltrierten Blätter der transgenen ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP-Linie bei einem DPI gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Blattproben wurden gemahlen und mit 2× SDS-Puffer gemischt, durch 5-minütiges Kochen bei 95 °C denaturiert und durch Western Blot analysiert. Ein monoklonaler, HRP-konjugierter Anti-GFP-Antikörper der Maus (Santa Cruz Biotechnology, Katalog-Nr. sc-9996 HRP) wurde in einer Verdünnung von 1:2.000 zum Nachweis von OSCA1.1-GFP verwendet. Die Signale wurden von Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) entwickelt und in einem Amersham Imager 600 nachgewiesen. Nach der Erkennung der GFP-Signale wurde die Western-Blot-Membran in Ponceau S gefärbt und mit Wasser gewaschen, um alle Proteinbanden im zu visualisieren Proben. Als Beladungskontrollen dienten die gefärbten Proteinbanden der Rubisco-Untereinheiten.

Die Größe der nachgewiesenen Proteine ​​wurde anhand einer PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific) beurteilt.

Die RNA-Seq wurde in drei unabhängigen biologischen Replikaten für nuc+XopD und nuc−XopD durchgeführt. Für jede Probe wurden etwa 500 pg Kern-RNA mit dem RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) aus ca. 105 Kernen extrahiert und 30 Minuten lang bei 37 °C mit DNase I (0,05 U pro μl, Thermo Fisher Scientific) weiterbehandelt, um jegliches zu entfernen genomische DNA kontaminieren. Die doppelsträngige (ds) cDNA wurde aus ca. 500 pg RNA durch zwei Runden linearer Amplifikation unter Verwendung des SMARTer Ultra Low Input RNA for Illumina Sequencing-HV-Kits (Clontech) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die Konzentration und Ausbeute der amplifizierten cDNA wurde mit dem Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Invitrogen) bestimmt. RNA-seq-Bibliotheken wurden mit dem Low Input Library Prep Kit (Clontech) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Qualität und Quantität der RNA-seq-Bibliotheken wurde mit dem High Sensitivity DNA Kit (Agilent) untersucht. Die Sequenzierung wurde auf dem NovaSeq 6000-System (Novogene, UK) durchgeführt. Für jede Probe wurden 33,2 bis 40,9 Millionen 2 × 150-bp-Paired-End-Reads gesammelt, die den Illumina-Qualitätskontrollfilter bestanden hatten (Ergänzungstabelle 8).

Das Entfernen des Adapters und die Qualitätsreduzierung der Lesevorgänge erfolgten mit AdapterRemoval v.2.1.7 (Parameter: -min Qualität 20, -min Länge 50)44. RNA-seq-Reads wurden dem Arabidopsis-Referenztranskriptom TAIR10 v.47 zugeordnet, wobei ribosomale RNA-Regionen (2:3471-9557; 3:14197350-14203988) maskiert wurden, unter Verwendung von TopHat 2.0.13 (keine gemischten Alignments; bis zu 20 sekundäre). Trassen; keine neuen Knotenpunkte)45. Lesezahlen für Transkripte wurden mit dem FeatureCounts-Programm in R46 berechnet und einer differenziellen Genexpressionsanalyse in DESeq2 (v.1.32.0) in R (v.4.1.0) unterzogen (Standardparameter; Signifikanzbedingungen: Basisexpression > 5, Falscherkennungsrate (FDR) angepasster P-Wert < 0,05, |log2FC| > 1)47.

Das Online-Tool AmiGO 248 (PANTHER-Überrepräsentationstest veröffentlicht am 20210224; GO-Ontologiedatenbank veröffentlicht am 2. Juli 2021) wurde verwendet, um GO-Begriffe in biologischen Prozessen zu identifizieren, die in XopD-abhängigen DEGs über- oder unterrepräsentiert sind. Es wurden Binomialtests durchgeführt und ein FDR-bereinigter P-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Die Darstellung des Genkonzept-Netzwerks wurde mit der cnetplot-Funktion im ClusterProfiler-Paket (clusterProfiler v.3.18.1)49 in R (v.4.0.5) durchgeführt.

Ungefähr 5 ng genomische DNA wurden mit dem DNeasy Plant Pro Kit (QIAGEN) aus etwa 1,5 × 105 Kernen jedes Probentyps extrahiert und mit RNase A (Thermo Scientific) behandelt, um jegliche kontaminierende RNA zu entfernen. Anschließend wurden ca. 5 ng DNA (einschließlich 0,02 ng nicht methylierter Lambda-DNA und 0,001 ng zugegebener >96 % methylierter pUC19-DNA) mit einem fokussierten Ultraschallgerät (Covaris E220-System) in Mikroröhrchen bei a in Fragmente von 100–500 bp geschert Einstellung von 175 Spitzeneinfallleistung, 10 Gleichstrom, 200 cpb für 40 s. Enzymatische Methylsequenzierungsbibliotheken (EM-seq) wurden aus gescherter DNA mit dem NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (New England BioLabs) hergestellt. Da die Menge des Ausgangs-DNA-Materials unter 10 ng liegt, der vom Hersteller empfohlenen Mindestmenge an Ausgangsmaterial, haben wir im letzten Schritt der PCR-Amplifikation der Sequenzierungsbibliotheken zwei PCR-Zyklen hinzugefügt. Bibliotheken wurden auf dem NovaSeq 6000-System (Novogene) sequenziert, um 2 × 150-bp-Paired-End-Reads zu sammeln, die den Illumina-Qualitätskontrollfilter bestanden haben (Ergänzungstabelle 8).

EM-seq-Lesevorgänge wurden mit trim_galore v.0.6.450 auf Adapter und Qualität getrimmt, bevor sie mit Bowtie v.2.2.3 auf das Arabidopsis-Referenzgenom (TAIR10 v.47) und die Kontrollsequenzen (Lambda- und pUC19-DNA) abgebildet wurden ( Punktzahl – min. L, 0, −0,6)51. Deduplizierung und Methylierungsinferenz wurden in Bismark v.0.22.352 durchgeführt, wobei weitere 3 bp an Leseenden basierend auf M-Bias ignoriert wurden. Die endgültigen Cytosinzahlen bei einer Mindestabdeckung von vier Lesevorgängen wurden je Kontext auf falsche Methylierung getestet, indem ein Binomialmodell basierend auf der Negativkontrolle (nicht methylierte Lambda-DNA) angepasst wurde. Das Benjamini-Hochberg-Verfahren wurde mit einem FDR-Schwellenwert von 5 % angewendet.

Angesichts der begrenzten Anzahl von auf Effektoren gerichteten Kernen, die bei eINTACT verfügbar sind, haben wir ∼5 × 104 Kerne aus jedem der drei biologischen Replikate (Probensammlung und Reinigung von Effektor-Empfänger-Kernen) kombiniert, um eine gepoolte Probe jedes Kerntyps zu erstellen. Um differenziell methylierte Regionen (DMRs) für jeden Kontext (CG, CHG, CHH) zu identifizieren, verwendeten wir daher DSS-single (v.2.38) in R (v.4.0.3), eine statistische Methode, die Informationen von benachbarten CG-Standorten nutzt zur Schätzung der biologischen Variation in einer einzelnen Probe, die nachweislich eine höhere Empfindlichkeit und Genauigkeit aufweist und auch ohne Replikate die biologisch aussagekräftigsten Ergebnisse liefert53. Für DMR-Anrufe wurde der Schwellenwert für den P-Wert pro Rest auf 0,05 festgelegt. Darüber hinaus wurde die erhaltene DMR-Liste auf der Grundlage strenger Grenzwerte mit einer Länge von >100 bp, einem mittleren Methylierungsunterschied >0,15 und einer Teststatistik von >10 gefiltert. Ein lokal installierter WashU Epigenome Browser wurde zur Visualisierung der DNA-Methylierung mit Einzelbasenauflösung54 verwendet.

Die DMR-überlappenden genomischen Merkmale wurden mithilfe des Arabidopsis-Referenzgenoms TAIR10 v.47 und der Araport11-Annotationsdateien für Transposon- und Pseudogenpositionen extrahiert. Um DMRs mit proteinkodierenden Genen zu assoziieren, wurden DMRs extrahiert, die sich in proximalen 3-kb-Regionen, 3 kb stromaufwärts des TSS bis 3 kb stromabwärts der Transkriptionsterminationsstelle, befanden. Die relativen Positionen zu Genen wurden von der Mitte des DMR bis zu den nächstgelegenen Gentermini (TSS oder Transkriptionsterminationsstelle) berechnet.

Um die Expressionsänderungen von RD29A in nuc + Um die relative Genexpression in Blattproben zu untersuchen, wurde RNA aus ein bis zwei Blättern jedes Probentyps mit dem RNeasy Plant Kit (Qiagen) extrahiert und mit DNase I (Thermo Fisher Scientific) behandelt, um jegliche kontaminierende genomische DNA zu entfernen. Die cDNA-Synthese wurde mit dem RevertAid First Strand cDNA-Synthesekit (Thermo Fisher Scientific) und dem Oligo-dT-Primer durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde mit genspezifischen Primern und HS Taq Master Mix (Biozyme) durchgeführt.

Die cDNA-Proben wurden als Vorlagen für qPCR-Reaktionen unter Verwendung von PowerUP SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) und genspezifischen Primern in einem CFX384 Touch Real-Time PCR-Gerät (Bio-Rad) verwendet. Die qPCR-Zyklusschwellenwerte (Ct) jedes untersuchten Gens wurden auf die durchschnittlichen Ct-Werte des TUB2-House-Keeping-Gens normalisiert und die relative Genexpression wurde unter Verwendung der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Da die Amplifikationssignale der XopD-Proben in mit DMSO behandelten transgenen ProXVE:XopD-Pflanzen die Nachweisschwelle nicht überschritten, wurde der Ct-Wert auf 40 festgelegt, die im PCR-Programm verwendete Anzahl von Zyklen, um die Unterschiede konservativ abschätzen zu können im Ausdruck.

Die qPCR-Analyse wurde mit zwei oder drei unabhängigen biologischen Replikaten jedes Probentyps durchgeführt, die gleichzeitig gezüchtet, aber unabhängig voneinander geerntet und verarbeitet wurden, mit drei technischen Replikationen pro Probe. Statistische Unterschiede wurden durch zweiseitige ungepaarte T-Test-Analyse berechnet.

Die nuc+XopD- und nuc−XopD-Proben wurden verwendet, wobei Gesamtkerne aus scheininokulierten Pflanzen als Kontrolle dienten. Die Expressionsniveaus von miR159a in diesen Proben wurden durch Stammschleifen-qPCR gemäß dem Protokoll in früheren Arbeiten31 mit einigen Modifikationen gemessen. Die Gesamt-RNA wurde aus etwa 105 Kernen jeder Kernprobe unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt und anschließend mit DNase I behandelt, um jegliche kontaminierende genomische DNA zu entfernen. Die cDNA-Synthese wurde unter Verwendung von PromeScript Reverse Transcriptase (Takara) mit einer Mischung aus Stamm-Loop-RT-Primern für jede miRNA und Oligo-dT-Primer für die Haushaltsgene ACTIN2/8 durchgeführt. Vor der qPCR wurde die cDNA für jedes der biologischen Replikate 12 Zyklen lang mit Phusion Polymerase (Thermo Scientific) und den miRNA-spezifischen Primern voramplifiziert. Die PCR-Bedingung bestand aus einem Zyklus bei 95 °C für 5 Minuten und 12 Zyklen bei 96 °C für 10 Sekunden, gefolgt von 60 °C für 30 Sekunden. Die voramplifizierten Produkte wurden unter Zugabe von Glykogen (Thermo Scientific) präzipitiert und in 10 μl DEPC-Wasser gelöst. Die gesamte Probe wurde dann als Vorlage für die qPCR-Reaktion verwendet, die in einem Reaktionsvolumen von 20 μl in einem CFX-Connect-Gerät von Bio-Rad unter Verwendung des SYBR Green Master Mix (Bio-Rad) für 40 Zyklen durchgeführt wurde. Die Ct-Werte jeder miRNA wurden auf die durchschnittlichen Ct-Werte von ACTIN2/8 normalisiert und die Faltungsänderung wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die qPCR-Analyse wurde für drei unabhängige biologische Replikate jedes Probentyps mit zwei technischen Replikationen pro Probe durchgeführt. Statistische Unterschiede wurden durch zweiseitige ungepaarte T-Test-Analyse berechnet und mit FDR für Mehrfachpaarvergleiche korrigiert.

Die Pflanzen wurden mit entsprechenden Bakterienstämmen durch die Verwundungsmethode inokuliert, wie im Abschnitt „Infektionstest“ beschrieben. Ab einem DPI wurden jeden Tag 20 μM ABA (Duchefa) in 100 μM NaOH und 0,02 % Silwet L–77 auf Xcc∆xopD*-infizierte Blätter gesprüht. Als Scheinkontrolle wurden mit 100 μM NaOH und 0,02 % Silwet L–77 besprühte Blätter verwendet.

Die ProXVE:XopD-Sämlinge (transgene Linie Nr. 38)11 wurden gekeimt und auf 1/2 MS-Agarplatten mit 12,5 µg ml−1 Hygromycin in Wachstumskammern unter Langtagbedingungen gezüchtet. Die zwei Wochen alten Sämlinge wurden in 1/2 MS-Flüssigmedium mit 20 μM β-Östradiol (gelöst in DMSO) oder nur DMSO überführt und auf einem 60-U/min-Schüttler in der Langtag-Wachstumskammer inkubiert. Nach einer 48-stündigen Inkubation wurden die Sämlinge gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren, bevor die Expression der interessierenden Gene mittels RT-qPCR analysiert wurde.

Die mit Xcc*AvrBs3 und XccΔxopD*AvrBs3 inokulierten Blätter der eINTACT-Reporterlinie wurden bei fünf DPI gesammelt. Die Blattgewebe wurden gewogen (50 mg ± 10 %) und in separate 2-ml-Safe-Lock-Röhrchen mit einer 5-mm-Stahlkugel überführt. Die Probenröhrchen wurden in flüssigem Stickstoff frisch eingefroren und bei –80 °C gelagert. Zur Extraktion endogener ABA wurde das Blattgewebe mit einer Retch-Mühle (2×15 s) unter intermittierender Kühlung in flüssigem Stickstoff gemahlen. Alle in den folgenden Schritten verwendeten Lösungsmittel (LC-MS-Qualität) wurden auf 8 °C vorgekühlt. Der gemahlenen Probe wurden 200 μl 80 %iges MeOH mit 50 nM D6-ABA (Isotopenstandard, OlChemIm) zugesetzt. Die Mischung wurde 5 Minuten lang in einem Ultraschallbad bei 16 °C inkubiert und anschließend 5 Minuten lang bei 4 °C und 18620 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein vorgekühltes Röhrchen überführt. Das verbleibende Pellet wurde mit 600 µl H2O 0,1 % Ameisensäure unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Schritt erneut extrahiert. Die kombinierten Überstandsfraktionen wurden direkt mittels gezielter LC-MS gemessen. Die LC-MS-Analyse wurde wie zuvor beschrieben55 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine Luna Omega Polar C18-Säule (3 μm; 100 Å; 150 × 0,5 mm; Phenomenex) und eine Luna C18(2)-Trap-Säule (5 μm; 100 Å; 20) verwendet wurden × 0,5 mm; Phenomenex) mit einer erhöhten Säulentemperatur von 55 °C und einer Flussrate von 28 µl min−1 für die Hauptsäule. Der ABA-Gehalt in einer Probe wurde gegen die D6-ABA-Werte normalisiert.

Die LC-MS-Analyse wurde für vier unabhängige biologische Replikate jedes Probentyps durchgeführt, die zu unterschiedlichen Zeiten gezüchtet und infiziert wurden, mit drei technischen Replikationen pro Probe. Statistische Unterschiede wurden durch zweiseitige ungepaarte T-Test-Analyse berechnet.

Acht Blätter, die entweder mit Xcc* oder Die Blätter wurden zu den Zeitpunkten 0, 20, 40, 60, 120 und 180 Minuten gewogen. Die Wasserverlustrate wurde als Prozentsatz des anfänglichen Frischgewichts berechnet. Es wurden die Mittelwerte für acht Blätter berechnet. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Ganze Blätter oder symptomatische Blattbereiche, die mit einem bestimmten Xcc-Stamm infiziert waren, wurden bei sieben DPI gesammelt und zwischen durchsichtigen Plastikfolien platziert. Die Blattgrößen (cm2) wurden anhand gescannter Bilder mit der ImageJ-Software (v.2.0.0-rc-69/1.52p) bestimmt. Anschließend wurde jede Blattprobe mit dem TissueLyser II (QIAGEN) in 400 µl sterilem Wasser in Safe-Lock-Röhrchen, die eine 5-mm-Keramikkugel enthielten, homogenisiert. Es wurden Reihenverdünnungen der Homogenate durchgeführt und ein 4-µl-Tropfen jeder Verdünnung dreimal auf Nährhefe-Glycerinplatten getupft, denen geeignete Antibiotika zugesetzt waren. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert und die Kolonien wurden an Stellen mit 3 bis 30 Kolonien gezählt. Der Mittelwert der Bakterienpopulationen pro cm2 Blattgewebe wurde mit drei technischen Replikationen pro Probe berechnet. Statistische Unterschiede (P < 0,05) zwischen zwei Probentypen wurden durch zweiseitige ungepaarte T-Test-Analyse berechnet und alle (>2) Probentypen wurden durch ANOVA analysiert, gefolgt von der ehrlich signifikanten Post-hoc-Tukey-Differenz. Experimente wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

RNA-seq- und EM-seq-Daten wurden in der ArrayExpress-Datenbank (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress) mit den Zugangsnummern E-MTAB-10280 und E-MTAB-10281 hinterlegt. Das Arabidopsis-Referenzgenom (TAIR10 v.47) und die Genanmerkung sind öffentlich verfügbar unter http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-47/. Araport11-Annotationen für Transposons und Pseudogene sind öffentlich verfügbar unter https://datacommons.cyverse.org/browse/iplant/home/araport/public_data/Araport11_Release_201606/annotation. Die Autoren erklären, dass alle weiteren Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Haupttext oder in den ergänzenden Materialien verfügbar sind. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Z.-M. Pei und F. Yuan für die Bereitstellung von osca1-1-, ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP- und Pro35S:OSCA1.1/osca1-1-Arabidopsis-Samen; D. Weigel für die Bereitstellung der Plasmide pFK-386 und pFK-209; J.-Y. Yang für die Bereitstellung von ProXVE:XopD-Arabidopsis-Samen; und AG Andrade-Galan für technische Unterstützung. Unsere Studie profitiert von der Infrastruktur des ZMBP und des Poznań Supercomputing and Networking Center; das LIPME als Teil des französischen Projekts Laboratory of Excellence (TULIP ANR-10-LABX-41; ANR-11-IDEX-0002-02) und die COST-Aktion CA16107 EuroXanth an LDN; und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 1101 Projekt D08 und LA 1338/9-1) an TL Diese Arbeit wurde gefördert durch das Zukunftsprogramm der Universität Tübingen (DFG, ZUK 63) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Nr. 427105396) bis YY

Abteilung für Allgemeine Genetik, Zentrum für Pflanzenmolekularbiologie (ZMBP), Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland

Yuan You, Robert Morbitzer, Danalyn R. Holmes und Thomas Lahaye

Abteilung für Biometrie und Bioinformatik, Institut für Pflanzengenetik, Polnische Akademie der Wissenschaften, Posen, Polen

Grzegorz Koczyk, Maria Nuc & Paweł Krajewski

Zentrale Einrichtungen - Analytik, ZMBP, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland

Edda von Roepenack-Lahaye

Staatliches Schlüssellabor für landwirtschaftliche Mikrobiologie, Hubei Schlüssellabor für Pflanzenpathologie, Hubei Hongshan Labor, Hochschule für Pflanzenwissenschaft und -technologie, Huazhong Agricultural University, Wuhan, VR China

Shiji Hou

Institut für Agrarbiotechnologie des Litorals (CONICET-UNL), Fakultät für Biochemie und Biowissenschaften, Nationale Universität des Litorals, Santa Fe, Argentinien

Axel Giudicatti und Paul A. Manavella

Labor für Pflanzen-Mikroben-Umwelt-Interaktionen (LIPME), Universität Toulouse, INRAE, CNRS, Castanet-Tolosan, Frankreich

Carine Gris & Laurent D. Noël

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YY beschaffte Fördermittel, überwachte die Arbeit und führte die meisten Experimente durch; GK analysierte EM-seq-Daten; MN und PK analysierten RNA-seq-Daten; RM vorbereitete dTALEs; DRH half beim Klonen und Immunblotting; EvR-L. gemessener ABA-Gehalt mittels LC-MS; SH führte eine GO-Analyse durch; AG und PAM führten Stamm-Loop-qPCR durch; CG-, RM-, YY-, CG- und LDN-präparierte Bakterienstämme; TL hatte die ursprüngliche Idee eines TALE-induzierbaren INTACT-Systems; und YY haben das Konzept bewiesen und das Arabidopsis-Xcc eINTACT-System entwickelt. YY analysierte die Gesamtergebnisse und verfasste das Manuskript mit Beiträgen von GK, DRH, LDN, PK und TL

Korrespondenz mit Yuan You.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Adam Bogdanove und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

XopD von Xanthomonas campestris pv. Der Campestris-Stamm 8004 (XopD in unserer Studie) enthält drei pflanzenspezifische, auf Ethylen reagierende Elementbindungsfaktor-assoziierte amphiphile Repressionsmotive (EAR) (rot) am N-Terminus, gefolgt von einer C-terminalen Cysteinproteasedomäne (lila). eine pflanzliche Kernlokalisierungssequenz (NLS) am C-Terminus. XopDXe aus dem X. euvesicatoria-Stamm 85-10 (Xe85-10) enthält eine N-terminale Verlängerungssequenz (grau) und eine mutmaßliche DNA-bindende Helix-Loop-Helix-Domäne (DBD, grün), die in XopD fehlen. XopDXe hat nur zwei EAR-Motive.

(a) Anreicherung des NTF-Proteins in eINTACT-gereinigten Kernen. NTF- und H3-Proteinnachweis mittels Western Blot der gesamten Kernproteinextrakte aus Xcc*vec1-infizierten Blättern (Xcc*vec1, Spur B), der gesamten Kerne (Xcc*AvrBs3, Spur C) und der mit eINTACT gereinigten Kerne (nuceINTACT, Spur D) aus Xcc*AvrBs3-infizierten Blättern. Die geblottete Membran wurde entsprechend den Größenmarkierungen in der Proteinleiter (Spur A) in zwei Teile zwischen 15 kDa und 25 kDa geteilt. Der obere Teil (25–180 kDa) wurde zum Nachweis von biotinyliertem NTF-Protein unter Verwendung der alkalischen Streptavidin-Phosphatase verwendet. Der untere Teil (10–15 kDa) wurde zum Nachweis des H3-Proteins mithilfe eines Anti-H3-Antikörpers verwendet. Die Häufigkeit des H3-Proteins dient als interne Kontrolle der Anzahl der Kerne in jeder Probe. Als Positivkontrolle wurde eine Probe der Gesamtkerne aus scheininokulierten Blättern einer Pro35S-INTACT-Reporterlinie verwendet, die biotinylierten NTF unter der Kontrolle des 35S-Promotors überexprimiert (Pro35S-INTACT, Spur E). Das Experiment wurde zweimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. (b) Ein repräsentatives Blatt der eINTACT-Reporterlinie, geimpft mit Xcc*AvrBs3 und ein repräsentatives Wildtyp-Col-0-Blatt, geimpft mit Xcc*vec1 bei sieben DPI. (c) Ein Boxplot, der die Bakterienpopulationsdichte in n = 12 Blättern der eINTACT-Reporterlinie darstellt, die mit Xcc*AvrBs3 inokuliert wurden, und n = 12 Wildtyp-Col-0-Blättern, die mit Xcc*vec1 bei sieben DPI inokuliert wurden. Horizontale Linien von oben zeigen Maxima-, obere Quartil-, Median-, untere Quartil- und Minimawerte: Kreuzmarkierungen zeigen die Mittelwerte; und kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate. Die n = 12 Blätter wurden von 4–6 verschiedenen Pflanzen gesammelt. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (eINTACT-Reporterlinie versus Spalte 0, P = 0,525). ns, nicht signifikant (P > 0,05).

Quelldaten

(a) Heatmaps, die die mC-Werte in jedem Kontext und die Dichte von Genen und transponierbaren Elementen (TEs) innerhalb von 100-kb-Bins über das gesamte Genom zeigen. Die maximalen mC-Werte betragen 0,88 (mCG), 0,50 (mCHG), 0,17 (mCHH). (b) Globale Grade der DNA-Methylierung in nuc+XopD und nuc−XopD. (c) Anzahl jeder Art von differentiell methylierten Regionen (DMRs) im Vergleich von nuc+XopD gegenüber nuc−XopD. DMRs werden in Heatmaps nach AreaStat-Werten (10–100, DSS-Teststatistik) sortiert. (d) Fraktionen von DMRs, die mit TEs, proteinkodierenden (PC) Genen, anderen Genen und keinen genomischen Merkmalen überlappen. Einige DMRs gehören mehreren Kategorien an. (e) Überlappung zwischen 3 kb großen proximalen Regionen von PC-Genen und DMRs. Andere beziehen sich auf DMRs, die nicht mit 3-kb-nahen Genregionen überlappen. TSS, Transkriptionsstartstelle; TTS, Transkriptionsterminationsstelle. Einige DMRs gehören mehreren Kategorien an.

(a–e) Die Daten werden als Mittelwerte +/− sd (Fehlerbalken) aus n = 2 oder 3 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (Xcc∆xopD*AvrBs3 inokulierte Blätter versus ; OSCA1.1, P = 0,704). ns, nicht signifikant (P > 0,05).

Quelldaten

Dieses Indexsystem wurde von Guy et al.19 modifiziert: 0, keine Symptome; 0,5 bis 1,5, schwache Chlorose; 2 bis 3, starke Chlorose. Der Grad des Welkens und der Nekrose wurde in diesem Indexsystem nicht berücksichtigt.

(a) Genmodell von OSCA1.1, das die Positionen von Wildtyp-OSCA1.1-spezifischen Primerpaaren zeigt, die an ihren 3'-Enden die in osca1-1 mutierten Kernsäuren enthalten. (b) Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis von Wildtyp-OSCA1.1-Transkripten in Col-0-, osca1-1- und Pro35S:OSCA1.1/osca1-1-Pflanzen. Das Experiment wurde zweimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. (c) Ein Boxplot, der die Krankheitsindexwerte (0, keine Symptome; 0,5 bis 1,5, schwache Chlorose; 2 bis 3, starke Chlorose) von jeweils n = 30 von Col-0, osca1-1 oder Pro35S:OSCA1.1/osca1 darstellt -1 mit Xcc* infizierte Blätter von 8 einzelnen Pflanzen bei sieben DPI. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (Col-0 vs. osca1-1, P = 2,89e-5; Col-0 vs. Pro35S:OSCA1.1/osca1-1, P = 0,038; osca1-1 vs Pro35S:OSCA1.1/osca1-1, P = 0,014). *P < 0,05, ***P < 0,001. (d) Ein Boxplot, der die Bakterienpopulationsdichte in jeweils n = 12 Col-0-, osca1-1- oder Pro35S:OSCA1.1/osca1-1-Blättern darstellt, die mit Xcc* aus 4 verschiedenen Pflanzen bei sieben DPI infiziert waren. KBE, koloniebildende Einheiten. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (Col-0 vs. osca1-1, P = 0,0009; Col-0 vs. Pro35S:OSCA1.1/osca1-1, P = 0,011; osca1-1 vs. Pro35S:OSCA1). .1/osca1-1, P = 0,0485). (c, d) Auf diesen Boxplots zeigen horizontale Linien von oben Maxima-, obere Quartil-, Median-, untere Quartil- und Minimawerte; Kreuzmarkierungen zeigen die Mittelwerte an; und kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate. (d) Mit repräsentativem Xcc* inokuliertes Col-0, osca1-1 oder Pro35S:OSCA1.1/osca1-1 verlässt bei sieben DPI.

Quelldaten

(a) Grafische Beschreibung, die die Positionen der EBEs von dTALE#1 und dTALE#2 im OSCA1.1-Genpromotor und die vorhergesagten Regionen (80–150 bp stromabwärts der EBEs) der TSSs von dTALE-aktivierten Transkripten zeigt. (b) Immunblotting-Nachweis des OSCA1.1-GFP-Proteins in Mock (Spur B), Xcc∆xopD*vec2 (Vektor, Spur C), Xcc∆xopD*dTALE#1 (dTALE#1, Spur D) und Xcc∆xopD *dTALE#2 (dTALE#2, Spur E) infiltrierte Blätter der transgenen Linie ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP. (c) Ponceau S-Färbung der in (b) verwendeten Membran. Als Ladungskontrollen wurden die gefärbten Proteinbanden der großen Rubisco-Untereinheit (Rubisco-ls) und der kleinen Rubisco-Untereinheit (Rubisco-ss) angegeben. (b, c) Die Experimente wurden zweimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Der ABA-Gehalt wurde durch LC-MS für n = 4 biologische Replikate mit 3 technischen Wiederholungen pro Probe quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwerte +/− sd (Fehlerbalken) aus n = 4 unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (Xcc*AvrBs3-infizierte Blätter versus XccΔxopD*AvrBs3-infizierte Blätter, P = 0,438). ns, nicht signifikant (P > 0,05).

Quelldaten

Horizontale Linien von oben zeigen Maxima-, obere Quartil-, Median-, untere Quartil- und Minimawerte; Kreuzmarkierungen zeigen die Mittelwerte an; und kleine Kreise zeigen Datenpunkte einzelner biologischer Replikate. Die n = 12 Blätter wurden von 4–6 verschiedenen Pflanzen gesammelt. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (Xcc* infizierte Blätter versus XccΔxopD* infizierte Blätter: 1 DPI, P = 0,178; 3 DPI, P = 0,581; 5 DPI, P = 0,124; 7 DPI, P = 0,731 ). ns, nicht signifikant (P > 0,05).

Quelldaten

Ergänzender Text.

Ergänzungstabellen 1–8. Ergänzende Tabelle 1: Differenzielle Genexpression zwischen nuc+XopD und nuc-XopD. Ergänzende Tabelle 2: GO-Anreicherung signifikant unterschiedlich exprimierter Gene im biologischen Prozess. Ergänzende Tabelle 3: Profile aller CG-, CHG- und CHH-DMRs im Vergleich von nuc+XopD vs. nuc-XopD. Ergänzende Tabelle 4: Die 19 DEGs mit DMRs, die sich in 3-kb-proximalen Promotorregionen befinden. Ergänzende Tabelle 5: Expressionsänderungen ausgewählter SA-bezogener Abwehrgene in nuc+XopD vs. nuc-XopD. Ergänzende Tabelle 6: Sequenzen von Primern. Ergänzende Tabelle 7: In dieser Studie verwendete Plasmide und Xcc-Stämme. Ergänzende Tabelle 8: Eigenschaften der RNA-seq- und Methyl-seq-Daten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

You, Y., Koczyk, G., Nuc, M. et al. Das eINTACT-System untersucht die bakterielle Ausnutzung pflanzlicher Osmosignale zur Steigerung der Virulenz. Nat. Pflanzen 9, 128–141 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01302-y

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Eingegangen: 30. November 2021

Angenommen: 28. Oktober 2022

Veröffentlicht: 22. Dezember 2022

Ausgabedatum: Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01302-y

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