Die Kombination zweier genetisch geschlechtsspezifischer Stämme ermöglicht die Sortierung nicht

Kommunikationsbiologie Band 6, Artikelnummer: 646 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die chemische Bekämpfung der krankheitsübertragenden Mücken Aedes albopictus und Aedes aegypti ist kostspielig, nicht nachhaltig und aufgrund der Ausbreitung von Insektizidresistenzen zunehmend ineffektiv. Die Sterile-Insekten-Technik ist eine wertvolle Alternative, wird jedoch durch langsame, fehleranfällige und verschwenderische Methoden zur Geschlechtertrennung eingeschränkt. Hier präsentieren wir vier genetische Geschlechtsstämme (zwei für jede Aedes-Art), die auf Fluoreszenzmarkern basieren, die mit den m- und M-Sexorten verknüpft sind und die Isolierung transgener Männchen ermöglichen. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Kombination dieser Geschlechtsstämme die Produktion nicht-transgener Männchen ermöglicht. In einer Massenaufzuchtanlage könnten 100.000 männliche Larven im ersten Stadium in weniger als 1,5 Stunden sortiert werden, mit einer geschätzten weiblichen Kontamination von 0,01–0,1 % auf einer einzigen Maschine. Kosteneffizienzanalysen ergaben, dass der Einsatz dieser Stämme zu erheblichen Einsparungen beim Aufbau und Betrieb einer Massenaufzuchtanlage führen könnte. Insgesamt sollten diese genetischen Geschlechtsstämme eine deutliche Ausweitung der Kontrollprogramme gegen diese wichtigen Vektoren ermöglichen.

Aedes aegypti und Aedes albopictus sind invasive Mückenarten, die für die Übertragung vieler Krankheitserreger verantwortlich sind, darunter Dengue- (DENV), Chikungunya- (CHIKV), Zika- (ZIKV) und Gelbfieberviren (YFV)1,2. Aufgrund des Klimawandels und des weltweiten Handels verbreiten sich beide Vektoren schnell und es wird prognostiziert, dass bis 2050 49 % der Weltbevölkerung dem Risiko von durch Aedes übertragenen Krankheiten ausgesetzt sein werden, wenn keine wirksamen Kontrollmaßnahmen ergriffen werden3,4.

Die Unterdrückung von Mückenpopulationen durch genetische Kontrolle ist eine der wirksamsten, nachhaltigsten und umweltfreundlichsten Alternativen zum Einsatz von Insektiziden. Es beruht auf wiederholten Massenfreisetzungen nicht stechender männlicher Mücken – entweder steril (die Sterile Insect Technique, SIT5 und ihre Derivate, einschließlich pgSIT6), mit Wolbachia infiziert (die inkompatible Insektentechnik, IIT7,8,9), beide10,11 oder Träger eines tödlichen Transgens (Release of Insects Carrying a Dominant Lethal, RIDL)12. Für alle diese Eingriffe ist eine effiziente Methode der Geschlechtertrennung erforderlich. Derzeit erfolgt die Geschlechtsbestimmung von Aedes-Mücken anhand des natürlichen Dimorphismus der Puppengröße mithilfe eines Hoch-Sortierers, der entweder vollständig manuell13,14 oder teilweise automatisiert11 erfolgen kann. Diese Methode, die eine homogene Puppengröße und damit dichteoptimierte Larvenaufzuchtbedingungen erfordert, weist den Nachteil weiblicher Kontaminationsraten zwischen 0,8 und 1 % und einer hohen täglichen und Benutzer-zu-Benutzer-Variabilität auf15. Insbesondere wurde kürzlich ein mehrstufiger Sortierer für Puppen und Erwachsene beschrieben, der eine weibliche Kontamination von 1,13 × 10−7 % ermöglichte9. Allerdings hat dieses System wie alle anderen existierenden Methoden den Nachteil, dass es zu einem späten Zeitpunkt sortiert und weniger als die Hälfte der aufgezogenen Männchen gewonnen wird14, was bedeutet, dass mehr als 75 % aller Puppen vergeblich aufgezogen und gefüttert werden.

Bei Anopheles-Mücken wurden transgene genetische Geschlechtsstämme (GSSs) beschrieben, die eine automatisierte Geschlechtstrennung junger Larven ermöglichen16,17,18,19. Fluoreszierende Marker zeigen eine männlich-spezifische Expression an, entweder durch die Verwendung männlich-spezifischer regulatorischer Sequenzen oder durch die Verknüpfung von Markern mit dem Y-Chromosom. Ein Geschlechtsstamm von Anopheles coluzzii ist X-chromosomal20, wodurch Weibchen fluoreszierender sind als Männchen. Die Geschlechtertrennung erfolgt mithilfe eines COPAS-Geräts (Complex Object Parametric Analyzer and Sorter), das als Durchflusszytometer fungiert und große Partikel nach ihrer Fluoreszenz sortiert. Darüber hinaus wurde als Alternative zur Freisetzung transgener Männchen ein Kreuzungsschema vorgeschlagen, das mithilfe von COPAS nicht-transgene, nur männliche Populationen erzeugt21. Dieses Schema erfordert einen Stamm, der einen Fluoreszenzmarker auf dem Y-Chromosom trägt, und einen anderen, der einen Fluoreszenzmarker auf dem X-Chromosom trägt. Die Kreuzung nicht-transgener (X−/X−) Weibchen des ersten Stamms mit transgenen (X+/Y−) Männchen des zweiten Stamms führt zu Nachkommen, die aus transgenen (X+/X−) Weibchen und nicht transgenen (X−/Y) bestehen −) Männer.

Bei Aedes-Mücken gibt es GSSs, die eine Geschlechtssortierung transgener Männchen ermöglichen. Zwei Studien haben die Verwendung eines reprimierbaren, frauenspezifischen flugunfähigen Phänotyps vorgeschlagen22,23. In diesem System werden transgene Männchen und Weibchen gemeinsam freigelassen, erwachsene Weibchen überleben jedoch nicht lange, da sie nicht fliegen können. Eine Methode, die eine solche Geschlechtssortierung und Sterilisation kombiniert, wurde entwickelt und an Ae angepasst. aegypti für SIT6,24. Allerdings erfordert dieses System eine perfekte Geschlechtssortierung der zu kreuzenden Elternstämme, andernfalls könnten fruchtbare transgene Mücken (von denen einige homozygot für ein Cas9-Transgen sind) freigesetzt werden. In Ae. aegypti, ein Rote-Augen-GSS, wurde ebenfalls entwickelt und hat sich für die Sortierung im Puppenstadium als effizient erwiesen, erfordert jedoch eine Automatisierung25. Kürzlich haben wir ein GSS für Ae entwickelt. albopictus trägt einen Fluoreszenzmarker in einer maskulinisierenden transgenen Kassette und ermöglicht so die automatisierte Trennung transgener Männchen von nicht-transgenen Weibchen26.

Hier untersuchten wir, ob bei Aedes-Mücken trotz des Fehlens heteromorpher Geschlechtschromosomen ein Kreuzungsschema ähnlich dem für Anopheles entwickelt werden kann. Bei Aedes wird das Geschlecht durch nicht homologe Geschlechtsorte kodiert, die sich auf dem ersten Autosomenpaar befinden. Der männliche Genort heißt „M“, während der gemeinsame Genort „m“ heißt; Somit sind Weibchen m/m und Männchen m/M. Diese Sexualorte sind in Ae etwa 1,18 Mbit/s lang. aegypti27 und werden durch antagonistische Faktoren begrenzt, die sie vor einer Rekombination schützen28,29. Sie sind in eine 63-Mbp-Region mit starker genetischer Differenzierung zwischen Mann und Frau eingebettet, in der die Rekombination unterdrückt bleibt30. Folglich könnte die Verknüpfung eines Fluoreszenzmarker-Transgens mit den Aedes-Sexorten oder mit der umgebenden nicht rekombinierenden Region eine automatisierte Sortierung entweder transgener Männchen direkt aus einem M-gebundenen Stamm oder nicht-transgener Männchen nach Kreuzung hemizygoter m-transgener Männchen mit ermöglichen Wildtyp-Weibchen. In dieser Arbeit haben wir mithilfe von Genomeditierung und Transgenese zwei GSSs für beide Aedes-Vektorarten entwickelt, eines mit dem M-Locus und eines mit dem M-Locus. Wir zeigen, dass diese GSSs einzeln zur Freisetzung transgener Mücken oder kombiniert zur Reinigung großer Populationen männlicher Wildtypen verwendet werden können. Wir diskutieren die Eignung der Methode für Massenaufzucht und Überschwemmungsfreisetzungen.

In Ae. aegypti wurde die Verknüpfung eines eGFP-Marker-Transgens mit den m- und M-Loci durch CRISPR-Cas9-Knock-in erreicht, das auf ein Mucin-3A-Gen, AAEL019619, abzielte, von dem vorhergesagt wurde, dass es zentral für die nicht rekombinierende Region ist, die die Geschlechts-Loci umfasst Fontaine und Kollegen30 (Abb. 1a, b, weitere Einzelheiten siehe Methoden). Wir haben ein Ae isoliert. aegypti M-verknüpfter Stamm, den wir Aaeg-M nannten, und ein Ae. aegypti m-verknüpfter Stamm, den wir Aaeg-m nannten. Die von einem allgegenwärtigen Promotor exprimierte GFP-Fluoreszenz ermöglicht die Geschlechtertrennung im ersten Larvenstadium: Bei Aaeg-M exprimieren die Männchen GFP, während die Weibchen nicht transgen sind (Abb. 1a), und bei Aaeg-m exprimieren die Männchen eine Kopie des GFP-Transgens. während Frauen zwei Kopien exprimieren, was zu einer helleren Fluoreszenz führt (Abb. 1b). Beide Linien wurden siebenmal auf einen brasilianischen genetischen Hintergrund (Bra) zurückgekreuzt. In Ae. albopictus, M-Verknüpfung von Fluoreszenzmarkern wurde durch bevorzugte piggyBac-Insertionen in der Nähe des Maskulinisierungsgens Nix erreicht, stimuliert durch den Einschluss von Nix-abgeleiteten Sequenzen in das piggyBac-Transgeneseplasmid (Abb. 1c, siehe Methoden). Ein ähnliches Phänomen, das als Transposon-Homing bezeichnet wird, wurde zuvor für P-Elemente in Drosophila beobachtet31. Dieser Ansatz ergab mindestens acht Linien mit enger M-Verknüpfung aus etwa 60 gescreenten piggyBac-Insertionen (bemerkenswerterweise wurde mit diesen piggyBac-Konstrukten ohne Nix-Sequenz keine oder nur eine schwache M-Verknüpfung erhalten). Unter den eng M-verknüpften Ae. Albopictus-Stämme wählten wir einen aus, der YFP exprimierte und den wir Aal-M nannten. Die Sequenzierung (siehe „Gezielte Sequenzierungsmethode“ im Abschnitt „Methoden“) ergab, dass das Transposon in einer nichtkodierenden Sequenz im Gerüst 16 gelandet war, das sich laut der neuesten Genomassemblierung auf 1q12 befindet32. Um einen zweiten Geschlechtsstamm mit m-Verknüpfung zu erhalten, ohne dass die Ae bekannt ist. In der Albopictus m-Locus-Sequenz haben wir > 120 zufällige piggyBac-Insertionen gescreent (Abb. 1d). Die beste m-verknüpfte Insertionslinie, die wir erhalten haben, zeigte eine Rekombinationshäufigkeit von 0,1 %. Seine transgene Kassette enthielt ein Cas9-Transgen, das mit einem DsRed-Fluoreszenzmarker assoziiert war, und war von lox-Stellen flankiert. Da ein Cas9-Transgen in einem Geschlechtsstamm unerwünscht war, haben wir es mithilfe der CRE-Rekombinase herausgeschnitten und durch ein eGFP-Transgen ersetzt. Dieses Ae. Der m-verknüpfte Stamm von albopictus wurde als Aal-m bezeichnet. Die Sequenzierung der flankierenden Genomsequenz des Transposons zeigte, dass es in einer stark wiederholten Region gelandet war; Daher konnte der genaue Genomstandort nicht identifiziert werden, stimmte jedoch mit mehreren Loci in 1q31 überein (siehe Methoden und ergänzende Daten 1). Sowohl Ae. Transgene Albopictus-Linien zeigen in COPAS-Analysen ein klares Geschlechtstrennungsmuster (Abb. 1c, d). Alle vier Linien wurden bei jeder Generation fluoreszenzsortiert und gescreent. In der Aaeg-M-Linie wurde ein einzelnes Rekombinationsereignis nach 15 Generationen (insgesamt > 10.000 untersuchte Personen) visuell aufgezeichnet. Folglich haben wir geschätzt, dass die Aaeg-M- und Aaeg-m-Linien zu etwa 0,01 % rekombinieren. In Aal-M wurden vier rekombinante Individuen in der zehnten Generation beobachtet, nachdem insgesamt >50.000 Individuen sukzessive gescreent wurden. Diese Rekombinationen sind wahrscheinlich auf ein einzelnes Ereignis zurückzuführen, was darauf hindeutet, dass Rekombinationen auch beim Aal-M-Stamm äußerst selten sind.

In Ae. aegypti wurde ein einzelnes CRISPR-Cas9-Ziel verwendet, um innerhalb von 2–4 Generationen einen M-verknüpften Stamm (a) und einen m-verknüpften Stamm (b) zu erhalten. Beide Linien ermöglichen eine Geschlechtertrennung mithilfe eines COPAS-Durchflusszytometers, wie in den Diagrammen dargestellt, die aus repräsentativen Sortierdaten für diese Linien (willkürliche Fluoreszenzeinheiten) erstellt wurden. In Ae. albopictus, M-Verknüpfung wurde durch bevorzugte Integration von piggyBac in der Nähe des M-Locus erhalten, stimuliert durch das Vorhandensein von Nix-Sequenzen, was ein Screening und Testen über 4 Generationen erforderte (c). „pB Trp“ = Helferplasmid, das die piggyBac-Transposase exprimiert. In Ae. albopictus, m-Verknüpfung wurde durch zufällige Integration von piggyBac durch intensives Screening über 6 Generationen erhalten (d). Die ausgewählte m-verknüpfte Linie wurde dann modifiziert, um unerwünschte Transgene mithilfe von CRE-Rekombinase („CRE“), einer Integrase („INT“) und einem GFP-exprimierenden Plasmid zu entfernen, das an die attP-Stelle andockte, die nach der Entfernung der lox-Kassette übrig blieb. Sowohl Aal-M als auch Aal-m ermöglichen eine Geschlechtertrennung mithilfe eines COPAS-Durchflusszytometers (repräsentative Sortierung anhand tatsächlich angezeigter Daten, in willkürlichen COPAS-Fluoreszenzeinheiten). Abbildung entworfen auf BioRender.com.

In beiden Ae wurde ein Pilotversuch zur Gewinnung nicht-transgener Männchen unter Verwendung von zwei GSS durchgeführt. aegypti und Ae. albopictus. In Ae. aegypti, 1000 negative Weibchen von Aaeg-M wurden COPAS-sortiert (Abb. 2a) und mit 300 COPAS-sortierten hemizygoten Männchen von Aaeg-m gekreuzt (Abb. 2b). Ihre Nachkommenschaft (Aaeg-CS, „CS“ steht für „Crossing Scheme“) bestand aus 65.839 Larven, von denen 32.960 negativ und angeblich männlich waren (Abb. 2c). Wir haben 2000 von ihnen per COPAS extrahiert, bei denen es sich allesamt um nicht-transgene Männchen handelte. In Ae. albopictus haben wir das gleiche Kreuzungsschema angewendet, indem wir 850 negative Weibchen aus dem Aal-M-Stamm mit 250 hemizygoten Männchen aus dem Aal-m-Stamm gekreuzt haben (Abb. 2d-e). Als Nachkommen erhielten wir 24.239 Aal-CS-Larven, von denen 12.173 negativ und vermutlich männlich waren (Abb. 2f). Von den 2000 negativen COPAS-extrahierten Larven wurden 1468 Puppen geborgen und visuell überprüft, was das Vorhandensein eines kontaminierenden nicht-transgenen Weibchens zeigte, was mit der geschätzten Rekombinationsrate des Aal-m-Stammes von 0,1 % übereinstimmt.

Die Panels zeigen die von der COPAS-Software angezeigten Fluoreszenzdiagramme log(Grün) = f(log(Rot)). Die Software zeigt keine Skalen an, da sie beliebige Fluoreszenzeinheiten verwendet. Für die Sortierung der interessierenden Populationen wurden abgegrenzte Regionen definiert. Bemerkenswert ist, dass sowohl GFP- als auch YFP-Fluorochrome im GFP-Modus gelesen werden können. a Sortierung nicht-transgener Weibchen aus dem Aaeg-M-Stamm. Gesamtzahl der Larven = 6079. b Sortierung hemizygoter transgener Männchen aus dem Aaeg-m-Stamm. Gesamtzahl der Larven = 711. c Sortierung der nicht-transgenen Männchen in der Nachkommenschaft von 1000 nicht-transgenen Weibchen vom Stamm Aaeg-M, gekreuzt mit 300 hemizygoten transgenen Männchen vom Stamm Aaeg-m. Gesamtlarven = 65.839. d Sortierung nicht-transgener Weibchen aus dem Aal-M-Stamm. Gesamtzahl der Larven = 6797. e Sortierung hemizygoter transgener Männchen aus dem Aal-m-Stamm. Gesamtzahl der Larven = 1960. f Sortierung nicht-transgener Männchen in der Nachkommenschaft von 850 nicht-transgenen Weibchen des Stammes Aal-M, gekreuzt mit 250 hemizygoten transgenen Männchen des Stammes Aal-m. Gesamtzahl der Larven = 24.239. Es wurde beobachtet, dass es sich bei Larven mit mittlerer Fluoreszenz entweder um tote fluoreszierende Larven oder um Larven mit geringerer GFP-Expression zum Zeitpunkt der Sortierung handelte. Es wurde bestätigt, dass es sich bei allen Individuen, die das Puppenstadium erreichten, um Männer handelte. Abbildung entworfen auf BioRender.com.

Die Fitness der ausgewählten M- und m-verknüpften Linien sowie der Zwischenkolonie aus dem Geschlechtsschema (nicht-transgene Weibchen aus der M-verknüpften Linie gekreuzt mit hemizygoten transgenen Männchen aus der m-verknüpften Linie) wurde von analysiert Untersuchung der folgenden Parameter: Geschlechterverhältnis, Fruchtbarkeit (Anzahl der Eier pro Weibchen), Brutrate der Eier und Überleben von der Larve bis zum Erwachsenenalter. In Ae. aegypti, Linien Aaeg-M, Aaeg-m und die Zwischenkolonie aus dem Kreuzungsschema (Aaeg-CS) zeigten ähnliche Geschlechterverhältnisse wie die Bra WT-Linie (Abb. 3a, Ergänzungstabelle 1 und Daten 2). Die Fruchtbarkeit von Aaeg-M und Aaeg-m unterschied sich nicht von der von Bra (WT), während Aaeg-CS eine höhere Fruchtbarkeit aufwies (Abb. 3b). Aaeg-M-Eier schlüpften ähnlich wie Bra-Eier, während Aaeg-m-Eier und Aaeg-CS-Eier deutlich besser schlüpften (Abb. 3c). Das Überleben vom ersten Larvenstadium bis zum Erwachsenenstadium war bei Aaeg-M, Aaeg-m und Aaeg-CS im Vergleich zu Bra nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 3d). In Ae. albopictus unterschieden sich die Geschlechterverhältnisse der Aal-M-, Aal-m- und Aal-CS-Linien nicht signifikant von denen der Wildtyp-Linie BiA (Abb. 3e). Aal-M hatte eine signifikant höhere Fruchtbarkeit als BiA (WT), während Aal-m und Aal-CS ähnliche Fruchtbarkeiten wie WT aufwiesen (Abb. 3f). Eier aus den Aal-M- und Aal-CS-Linien hatten eine etwas höhere Schlupfrate als Eier aus BiA (WT), während Aal-m-Eier ähnlich schlüpften (Abb. 3g). Das Überleben von L1-Larven zu adulten Tieren war bei Aal-M und Aal-m im Vergleich zu BiA (WT) geringfügig erhöht, während es bei den Nachkommen des Kreuzungsschemas keinen signifikanten Unterschied aufwies (Aal-CS, Abb. 3h).

In allen Panels stellen die schwarzen Punkte mit vertikalen Balken den Mittelwert und das 95 %-KI im Ae dar. aegypti und Ae. Albopictus-Assays. Die großen farbigen Punkte um die Schätzungen stellen die Mittelwerte jedes Replikats dar (N). Signifikante Unterschiede zwischen den Linien sind in der Abbildung angegeben (ns: kein signifikanter Unterschied. *p-Wert < 0,1, **p-Wert < 0,01, ***p-Wert < 0,001). Die prozentualen Anteile der Männer wurden mithilfe eines verallgemeinerten linearen Modells mit einer Binomialverteilung im Ae verglichen. aegypti (a) und Ae. albopictus (e) Linien. Vergleiche der durchschnittlichen Anzahl der von einem einzelnen Weibchen gelegten Eier wurden mithilfe eines Hürdenmodells mit einer negativen Binomialverteilung im Ae analysiert. aegypti (b) und Ae. albopictus (f) Linien. Die Signifikanz des Hürdenmodells wird in zwei Teilen dargestellt: Wahrscheinlichkeit der Werte ungleich Null und Wahrscheinlichkeit, den Wert 0 zu erreichen (in Klammern). Vergleiche des Prozentsatzes der geschlüpften Eier wurden mithilfe eines verallgemeinerten linearen Modells mit einer Binomialverteilung im Ae analysiert. aegypti (c) und Ae. albopictus (g) Linien. Der Vergleich des Überlebens von Larven im ersten Larvenstadium bis hin zu adulten Stadien wurde unter Verwendung eines linearen Modells unter der Annahme einer verbleibenden Normalität in der Ae analysiert. aegypti (d) und Ae. albopictus (h) Linien. Abbildung entworfen auf BioRender.com.

Bei einem operativen SIT-Ansatz würden transgene Männchen aus den M-verknüpften Linien oder nicht-transgene Männchen aus dem Kreuzungsschema zur Freisetzung produziert. Zu diesem Zweck haben wir ihre Fitness durch Wettbewerbstests, Flugtests und zweiwöchige Überlebenstests unter Laborbedingungen beurteilt. Wir testeten die Konkurrenzfähigkeit transgener Männchen, indem wir 30 transgene Männchen und 30 WT-Männchen in einen Käfig mit 30 jungfräulichen WT-Weibchen setzten und den Prozentsatz der transgenen Nachkommen in ihren Nachkommen maßen. Im Wettbewerbsfähigkeitstest zwischen transgenen und nicht-transgenen Männchen in Ae. aegypti, Aaeg-M schnitten genauso ab wie Bra (WT) und Aaeg-CS (Abb. 4a, Ergänzungstabelle 1). In Ae. Albopictus würde angesichts der höheren Schlupfrate und Fruchtbarkeit von Aal-M im Vergleich zu BiA (WT) und Aal-CS bei gleicher Wettbewerbsfähigkeit in beiden Wettbewerbsfähigkeitstests zu höheren Prozentsätzen von Aal-M-Larven als erwartet führen. Aal-M zeigte eine Wettbewerbsfähigkeit von 0,59 im Vergleich zu BiA (WT) und eine ähnliche Wettbewerbsfähigkeit im Vergleich zu Aal-CS (Abb. 4b), was bedeutet, dass sowohl Aal-M als auch Aal-CS im Vergleich zu WT eine geringere Wettbewerbsfähigkeit aufwiesen. Die Flugfähigkeit der Männchen wurde durch einen standardisierten Test beurteilt, der darin bestand, 100 Männchen in einen kleinen Becher am Boden von vertikalen Röhren mit einem Fächer zu platzieren und zu zählen, wie viele Männchen es schafften, durch die Röhren zu entkommen33. Bei Flugtests wurde Ae. Aegypti-transgene Männchen und nicht-transgene Männchen aus dem Kreuzungsschema führten ebenso gut durch wie Kontrollmännchen, während in Ae. albopictus waren die Fluchtraten der Aal-M-Männchen geringfügig niedriger und die der Aal-CS-Männchen geringfügig höher als die der WT, ohne signifikanten Unterschied (Abb. 4c, d). Das Überleben der Erwachsenen wurde zwei Wochen lang überwacht und es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen transgenen Männern, nicht-transgenen Männern aus dem Kreuzungsschema und Männern aus ihren jeweiligen WT-Linien beobachtet (Abb. 4e–f).

Schwarze Punkte mit vertikalen Balken stellen den Mittelwert und das 95 %-KI in den Tests zur Wettbewerbsfähigkeit und männlichen Flugfähigkeit dar. Die dünnen farbigen Punkte in den Quadraten über und unter den Schätzungen stellen einzelne Datenpunkte (n) dar, während die großen farbigen Punkte um die Schätzungen die Mittelwerte jedes Replikats (N) darstellen. Signifikante Unterschiede zwischen den Linien sind in der Abbildung angegeben (ns: kein signifikanter Unterschied. *p-Wert < 0,1, **p-Wert < 0,01, ***p-Wert < 0,001). Die Konkurrenzfähigkeit der Männchen der Aaeg-M-Linie im Vergleich zu Bra (WT) oder Aaeg-CS in Ae. aegypti (a) und die Konkurrenzfähigkeit der Männchen der Aal-M-Linie im Vergleich zu BiA (WT) und Aal-CS in Ae. albopictus (b) wurden durch Messung der Anzahl transgener und nicht-transgener L1-Larven in den Nachkommen jedes der N = 5 Replikate verglichen. Die Ergebnisse wurden mit dem erwarteten Prozentsatz verglichen, wenn transgene Männchen ebenso konkurrenzfähig wären wie nicht-transgene Männchen (gestrichelte Linie) und mithilfe eines verallgemeinerten Mixed-Effects-Modells mit Binomialverteilung und Wiederholungen als Zufallseffekt analysiert. Die Flugfähigkeit transgener und nicht-transgener Männchen im Vergleich zum Wildtyp in Ae. aegypti (c) und Ae. albopictus (d) wurde in N = 3 Replikaten in einem Referenzflugtestgerät („FTD“) getestet. Die Ergebnisse wurden mithilfe eines verallgemeinerten Mixed-Effect-Modells mit Binomialverteilung analysiert und als Zufallseffekt repliziert. Das Überleben erwachsener Männchen 14 Tage nach dem Auftauchen wurde in Ae überwacht. aegypti (e) und Ae. albopictus (f) Linien. Für jede Linie wurden N = 4 Wiederholungen durchgeführt. Da alle Werte über 90 % liegen, ist die Y-Achse zur besseren Visualisierung zwischen 0 und 90 % diskontinuierlich. Das männliche Überleben nach 7 und 14 Tagen wurde mithilfe des Log-Rank-Tests verglichen, und keiner der Vergleiche war signifikant unterschiedlich. Abbildung entworfen auf BioRender.com.

Um die Zuverlässigkeit der COPAS-Sortierung für die Massenproduktion von Männchen mit hohem Durchsatz in einer Mückenproduktionsanlage zu beurteilen, haben wir die Kontaminationsrate als Funktion der Sortiergeschwindigkeit bewertet. Ein Pool von 10.000 Aaeg-CS-Larven im ersten Stadium (fluoreszierende Weibchen + nicht fluoreszierende Männchen) wurde wiederholt COPAS-sortiert und wir haben die männliche Erholungsrate und die weibliche Kontaminationsrate bei verschiedenen Sortiergeschwindigkeiten gemessen. Das Sortieren mit einer bestimmten Geschwindigkeit wurde N = 3 Mal wiederholt. Wir beobachteten, dass der Prozentsatz der Wiederfindung von 91,5 ± 1,4 % auf 26,9 ± 1,9 % sank, wenn die Sortiergeschwindigkeit von 6 auf 300 Larven/Sek. erhöht wurde, und zwar nach einem Polynom-Regressionsmodell zweiten Grades (R2 = 0,983), während unten keine Kontamination auftrat 300 Larven/Sek. (Abb. 5a). Wir gehen davon aus, dass die Betriebsgeschwindigkeit für die Geschlechtssortierung bei etwa 60 Larven/Sek. liegt (was bei unseren Instrumenteneinstellungen 200 Larven/ml im Reservoirwasser entspricht), mit einer durchschnittlichen Wiederfindungsrate von 69,6 ± 1,1 % und einer festgestellten weiblichen Kontamination unter mehr über 6500 sortierte Männchen. Bei dieser Geschwindigkeit fasst ein kleines COPAS-Reservoir (250 ml) 50.000 Larven, die in <14 Minuten sortiert werden, was etwa 17.400 ± 270 Männchen ergibt (unter Berücksichtigung eines Geschlechterverhältnisses von 50:50). Folglich konnten 100.000 Männchen in weniger als 1,5 Stunden aussortiert werden. Der gleiche Testlauf wurde mit Ae wiederholt. Albopictus-Larven und lieferte vergleichbare Ergebnisse (Abb. 5a).

a Entwicklung der Genesungsraten bei Männern und der Kontaminationsraten bei Frauen als Funktion der COPAS-Sortiergeschwindigkeit. 10.000 Ae. Aegypti-L1-Larven aus dem Kreuzungsschema wurden in unterschiedlichen Konzentrationen COPAS-sortiert, was zu unterschiedlichen Sortiergeschwindigkeiten führte. Der Prozentsatz der Rückgewinnung (schwarze Punkte) und der Prozentsatz der Kontamination (rote Punkte) wurden an drei Wiederholungen für jede Sortiergeschwindigkeit gemessen. Die Wiederherstellungswerte wurden mithilfe einer Polynomregression zweiten Grades (R2 = 0,983) angepasst, und die Kontaminationswerte wurden mithilfe einer linearen Regression (R2 = 0,556) angepasst. Die Modellvorhersagen wurden durch schwarze bzw. rote Linien mit Bändern für 95 %-Konfidenzintervalle dargestellt. Das gleiche Experiment wurde mit 4000 Ae wiederholt. albopictus L1-Larven aus dem Kreuzungsschema und wird in derselben Grafik dargestellt. Bei dieser Art wurden der Prozentsatz der Rückgewinnung (schwarze Dreiecke) und der Prozentsatz der Kontamination (rote Dreiecke) an einem einzelnen Replikat für jede Sortiergeschwindigkeit gemessen. b–g Schätzung der Kosteneffizienz genetischer Geschlechtsstämme für Aedes SIT durch Simulation des Aufbaus einer Massenaufzucht- und einer Freilassungsanlage mit unterschiedlichen Geschlechtssystemen. Zu den enthaltenen Geschlechtsbestimmungssystemen gehörten die manuelle Sortierung von Puppen mithilfe von Glasplatten, „Size Manual“ (gestrichelte schwarze Linien), die automatische Sortierung von Puppen mit Roboter-Glasplatten, „Size Auto“ (gestrichelte graue Linien) und die automatische Sortierung von L1-Larven aus ein GSS mit COPAS, „GSS“ (hellgrüne Linien), und die Kombination zweier GSS zur automatisierten Sortierung nicht-transgener L1-Larven, „GSS-CS“ (dunkelgrüne Linien). Es wurden verschiedene Produktionsziele in Betracht gezogen: Freilassung von 5, 10, 20, 50 und 100 Millionen Männchen pro Woche für 52 Wochen im Jahr. b Vergleich der Anzahl der zu jedem Zeitpunkt in der Aufzuchtanlage vorhandenen Larven. c Vergleich der Baukosten in US-Dollar für die Massenaufzucht- und Freilassungsanlagen. d Vergleich der Ausrüstungskosten in US-Dollar sowohl für die Massenaufzucht- als auch für die Freilassungsanlagen (jährliche Kostenschätzung durch Division der Kosten jeder Ausrüstung durch deren Lebensdauer). e Vergleich der Futter- und Verbrauchsmaterialkosten pro Jahr in US-Dollar für die Massenaufzucht- und Freilassungseinrichtungen. f Summe der jährlichen Kosten für Bau (geschätzte Lebensdauer = 20 Jahre), Ausrüstung, Ernährung und Verbrauchsmaterialien in US-Dollar. g Vergleich der Anzahl des Personals (Arbeiter, Manager usw.), das sowohl für die Massenaufzucht als auch für die Freilassungseinrichtungen benötigt wird. h Vorgeschlagene Chromosomeninversion, die eine Rekombination zwischen dem Fluoreszenzmarker und dem Geschlechtsort verhindern könnte. Abbildung entworfen auf BioRender.com.

Durch die Möglichkeit der Trennung von Männchen und Weibchen im ersten Larvenstadium (L1) wird die Anzahl der nachfolgenden Larvenstadien und Puppen, die in einer Massenaufzuchtanlage aufgezogen werden müssen, erheblich reduziert. Angesichts der Rekombinationsraten unserer transgenen Linien sind jedoch in der Massenaufzuchtanlage zusätzliche Kolonien erforderlich, die doppelt überprüft werden, um alle Verunreinigungen zu entfernen (sogenannte „Filterkolonien“). Darüber hinaus müssen teure Fluoreszenzsortiergeräte wie COPAS angeschafft werden. Durch die Anpassung des „FAO/IAEA INTERACTIVE SPREADSHEET FOR DESIGNING MOSQUITO MASS REARING AND MALE HANDLING FACILITIES“34 (siehe Methoden und ergänzende Daten 3) haben wir die Anzahl der zu züchtenden Insekten, die Anlagengrößen, die Belegschaft, die Konstruktion, die Ausrüstung usw. geschätzt Kosten für Verbrauchsmaterialien usw. Diese Schätzungen wurden zwischen standardmäßigen Aufzucht- und Sortierverfahren (im Folgenden „Size Manual“ für die manuelle Sortierung von Puppen basierend auf ihrem Größendimorphismus13 und „Size Auto“ für die automatische Sortierung von Puppen, die für das IIT-SIT entwickelt wurde) verglichen in Guangzhou, China11) sowie die Verwendung eines einzigen GSS (Sortierung transgener Männchen, als „GSS“ bezeichnet) und die Verwendung von zwei kombinierten GSS zur Sortierung nicht-transgener Männchen (als „GSS-CS“ bezeichnet). „CS“ steht für „Crossing Scheme“). Wir haben den Fall von GSS-CS (zur Produktion nicht-transgener Männchen) getrennt von dem von GSS betrachtet, da hierfür zwei Aufzuchtkolonien (eine für jeden zu verwendenden Stamm) und zwei Filterkolonien anstelle von einer erforderlich sind (siehe „Massenaufzuchtprozesse“) ' Schemata in den Zusatzdaten 3), die dazu führen, dass mehr Mücken gezüchtet werden müssen und zusätzlicher Platz und Ausrüstung erforderlich sind. Für alle Methoden wurden unterschiedliche Freisetzungsskalen (nämlich 5, 10, 20, 50 und 100 Millionen Männchen, die pro Woche freigelassen werden) getestet, je nachdem, was derzeit in Feldversuchen zur genetischen Kontrolle gegen Aedes durchgeführt wird (5 und 10 M/Woche). und was für eine umfassendere Aedes-Kontrolle operativ relevant wäre35. Wir haben beobachtet, dass sowohl GSS als auch GSS-CS eine erhebliche Reduzierung der Anzahl der zu züchtenden Insekten im Vergleich zum Standard ermöglichen, unabhängig von der Freisetzungsskala und einschließlich der Filterkolonien (GSS vs. Size Manual = −65 % Larven und −25). –30 % Erwachsene, GSS-CS vs. Größenhandbuch = –46 % Larven und –8–17 % Erwachsene, siehe Abb. 5b und ergänzende Daten 3). Diese Reduzierungen führen zu einer Verringerung der Größe der Massenaufzuchtanlage und damit der Baukosten: Es wird geschätzt, dass die Größe der Anlage und die Baukosten im GSS um 22–43 % und im GSS-CS um 12–28 % im Vergleich zum Größenhandbuch reduziert werden ( Abb. 5c). Angesichts der derzeit hohen Kosten von COPAS-Geräten (aktuellen Angeboten zufolge gingen wir von 40.000 US-Dollar für ein generalüberholtes Gerät aus) sind die Ausrüstungskosten bei GSS-CS im Vergleich zur manuellen Sortierung von Puppen höher (+9 bis +18 % pro Jahr, Abb. 5d). ), während GSS allein schätzungsweise die niedrigsten Ausrüstungskosten bei 10 Mio. Männern/Woche verursacht (–5 bis –16 % jährlich im Vergleich zum Größenhandbuch, Abb. 5d). Allerdings werden auch die Verbrauchsmaterialkosten, einschließlich der Kosten für die Insektenernährung, reduziert und ermöglichen erhebliche Einsparungen ab 20 Mio. Männchen/Woche und mehr (GSS vs. Größenhandbuch = −54 %, GSS-CS vs. Größenhandbuch = −37 %, mit Einsparungen von >50.000 $ bei 20 Mio. Männern/Woche und mehr, Abb. 5e). Unter Berücksichtigung der Bau-, Ausrüstungs-, Futter- und Verbrauchskosten wird GSS insgesamt voraussichtlich die wirtschaftlichste Option bei allen getesteten Durchsätzen sein, während GSS-CS im Vergleich zur manuellen Sortierung von Puppen aus einem Durchsatz von 10 Mio. Männchen/Woche wirtschaftlicher zu sein beginnt (Abb. 5f). Darüber hinaus wird der Arbeitsaufwand, dessen Kosten nur für jedes Land geschätzt werden können, mit GSS um 29–38 % und mit GSS-CS um 18–27 % reduziert (Abb. 5g). Bei allen Vergleichen, einschließlich der Gerätekosten, ist die automatische Sortierung von Puppen die teuerste Option, da die Geräte teuer sind (z. B. 40.000 US-Dollar für den automatischen Sortierer von11, J. Bouyer) und die Anzahl der zu züchtenden Insekten hoch ist (Abb . 5b–g).

Hier präsentieren wir die ersten genetischen Geschlechtsstämme (GSSs) für Ae. aegypti und Ae. albopictus basierend auf m/M-verknüpften transgenen Fluoreszenzmarkern. Wir zeigen, dass die M-verknüpften Aaeg-M- und Aal-M-Stämme allein zur Geschlechtsbestimmung transgener Larven im ersten Larvenstadium verwendet werden können und dass die M- und M-verknüpften Stämme jeder Art auch kombiniert werden können, um eine nicht-transgene männliche Population zu erzeugen durch zwei Runden der Geschlechtssortierung (der Elternstämme und der Nachkommen der Kreuzung). In Ae. aegypti, transgene Männchen aus dem M-verknüpften Stamm und nicht-transgene Männchen aus dem Kreuzungsschema erwiesen sich als mindestens genauso fit und konkurrenzfähig wie Wildtyp-Männchen desselben Laborstamms. In Ae. albopictus wurde eine leichte Verringerung der Konkurrenzfähigkeit sowohl bei transgenen Aal-M-Männchen als auch bei nicht-transgenen Aal-CS-Männchen beobachtet. Der Grund dafür ist unklar, insbesondere da Aal-CS-Männchen nicht transgen sind. Bei einer Geschwindigkeit von 60 Larven/Sekunde mit einem COPAS-Gerät schätzen wir, dass mit den aktuellen Einstellungen 100.000 Männchen in weniger als 1,5 Stunden gewonnen werden können, wobei 70 % der Männchen wiederhergestellt werden und die Kontamination der Weibchen bei 0,01–0,1 % liegt.

Unerwarteterweise beobachteten wir nach dem Screening Zehntausender Larven seltene Rekombinationsereignisse zwischen dem Transgen und dem M-Locus in der Aaeg-M-Linie. In dieser Linie befindet sich das Transgen etwa 9 Mbp von Nix entfernt, was deutlich innerhalb der vermuteten nicht rekombinierenden Region bleibt30. Verglichen mit der Wahrscheinlichkeit einer Rekombination zwischen zwei Markern, die an gewöhnlichen Orten durch den gleichen Abstand voneinander getrennt sind (3,4–4,7 % gemäß den neuesten genomischen Informationen27), bestätigen diese Ergebnisse, dass die Rekombination in dieser Region stark reduziert, aber nicht vollständig unterdrückt ist. Obwohl dies noch nicht beobachtet wurde, wird erwartet, dass die Aaeg-m-Linie mit der gleichen Häufigkeit wie Aaeg-M rekombiniert, da beide Transgene in einem ähnlichen Abstand von ihren jeweiligen Geschlechtsorten in dasselbe Zielgen eingefügt werden. Leider implizieren die Rekombinationsereignisse, dass diese GSS eine regelmäßige Reinigung der Elternkolonien erfordern, um eine allmähliche Anhäufung rekombinanter Individuen zu vermeiden. Bemerkenswert ist, dass solche Rekombinationsereignisse in gleichgeschlechtlichen Puppengruppen aufgrund des Größendimorphismus und der Protandrie leicht zu erkennen sind, was eine regelmäßige Qualitätskontrolle jedes Stammes erleichtert.

Obwohl unsere ersten Versuche, einen GFP-Marker in das große Intron von Nix einzuschleusen, fehlschlugen, können verbesserte GSSs konstruiert werden, indem Regionen näher an oder innerhalb der Geschlechtsorte, insbesondere in Ae, anvisiert werden. aegypti, das von einem vollständig zusammengesetzten Genom profitiert. In Ae. albopictus wurden seltene Rekombinationsereignisse auch bei Aal-M bei mehr als 10.000 über 10 Generationen untersuchten Individuen gefunden. Für eine genauere Bearbeitung des Genoms wäre bei dieser Art eine bessere Zusammensetzung des ersten Chromosoms erforderlich. Über die Möglichkeit einer genetischen Instabilität unter Bedingungen der Massenaufzucht und das Auftreten abweichender Geschlechtsrekombinanten wurde bereits bei der Entwicklung von GSSs in anderen Insektenmodellorganismen berichtet36. Alternativ könnte die Schaffung lebensfähiger chromosomaler Inversionen, die sich über den geschlechtsbestimmenden Ort und das fluoreszierende Transgen erstrecken, ähnlich einem Balancer-Chromosom, dazu beitragen, das Crossing-over zu unterdrücken (Abb. 5h)37,38. Allerdings müssen Inversionen sorgfältig analysiert werden, um sicherzustellen, dass sie nicht zu unerwünschten Fitnesskosten bei der Geschlechtsart führen, die bei anderen Arten beobachtet wurden39. Schließlich haben wir kürzlich berichtet, dass transgene Ae. Albopictus-Pseudomännchen, die durch ektopische Expression von Nix maskulinisiert wurden, können als Aal-M-GSS verwendet werden, bei dem der Fluoreszenzmarker eine absolute Verknüpfung mit dem Geschlecht zeigt26. Dieser GSS-Typ ist besonders interessant für die Produktion nicht-transgener Männchen, da in diesem Fall die von der Aal-M-Linie abgeleiteten und im Kreuzungsschema verwendeten Wildtyp-Weibchen sowohl nicht-transgen als auch frei von jeglicher rekombinanter Kontamination sind.

Die weiblichen Kontaminationsraten unserer GSSs (0,01 bis 0,1 %, abhängig von den Rekombinationsereignissen) sind höher als beim mehrstufigen Sortierer von Verily9, aber viel niedriger als bei manuellen13 oder automatisierten11 Glassortierern. Bemerkenswert ist, dass in aktuellen SIT-IIT-Tests bis zu 0,3 % der kontaminierenden Weibchen als akzeptabel angesehen wurden11,40, während bei SIT allein bis zu 1 % toleriert wird5,35,41,42,43. Darüber hinaus wären kontaminierende Weibchen der gleichen Strahlendosis ausgesetzt wie Männchen, was nachweislich zu 100 % Sterilität bei Weibchen führt44. Die größte Sorge bei diesen Kontaminationsraten besteht daher darin, dass kontaminierende Weibchen aus den Kolonien in den Massenaufzuchtanlagen entfernt werden müssen, damit sie sich nicht ansammeln. Dies wurde in unseren Simulationen berücksichtigt, indem Filterkolonien einbezogen wurden, die als Larven nach Geschlecht sortiert und als Puppen doppelt überprüft würden. In Fällen, in denen eine Kontamination der Freisetzungschargen näher bei 0 % erforderlich ist, könnte auch ein Qualitätskontrollschritt mithilfe automatischer Puppensortierer vor dem Auftauchen der erwachsenen Tiere implementiert werden.

Im Vergleich zu aktuellen Methoden zur Geschlechtertrennung bei Aedes-Mücken9,11,13,45,46 ermöglichen diese GSSs eine höhere männliche Erholung als jede Sortiermethode basierend auf der Puppengröße (etwa 70 % gegenüber 30 %). Unser System bietet eine Sortiergeschwindigkeit ähnlich der des automatischen Glassortierers, die höher ist als die von manuellen Größensortierern und mehrstufigen Sortierern. Im Vergleich zu all diesen derzeit verfügbaren Methoden besteht der Hauptvorteil unserer GSS darin, dass sie die Sortierung bereits im frühesten Entwicklungsstadium ermöglichen, was zu erheblichen Einsparungen an Platz, Zeit und Kosten führt, die sonst für die Aufzucht unnötiger Individuen aufgewendet würden. Darüber hinaus wird durch die Verringerung der Anzahl der Weibchen, die in der Massenaufzuchtanlage das Puppenstadium erreichen, die Belästigung durch Beißen für die Arbeiter verringert, ein Problem, das bei Methoden zur Puppensortierung aufgrund des frühen Schlüpfens der Erwachsenen häufig auftritt.

Darüber hinaus schlagen wir eine Kreuzungsstrategie vor, die sich bei der Gewinnung nicht-transgener Männchen als wirksam erwiesen hat. Diese Strategie könnte besonders in Ländern nützlich sein, in denen gentechnisch veränderte Insekten nicht streng verboten sind, die Freisetzung transgener Mücken jedoch große öffentliche Besorgnis erregen könnte. Im Vergleich zur Sortierung der Puppen nach Größe mithilfe von Glasplatten oder Metallsieben bietet sie den Vorteil, dass alle Sortierschritte automatisiert werden und deutlich geringere weibliche Kontaminationsraten erreicht werden. Obwohl es die Aufzucht von zwei Stämmen und die Sortierung der Männchen in der Massenaufzuchtanlage erfordert, bedeutet dies immer noch eine Reduzierung der Anzahl der Mückenlarven, die für die derzeitige größenbasierte manuelle Sortierung gezüchtet werden, um etwa 46 %. Trotz der hohen Kosten der Sortiergeräte und der höheren Insektenzahlen als bei GSS wird erwartet, dass diese Methode bei allen Durchsätzen kosteneffizienter ist als die automatische Sortierung von Puppen und bei einem Produktionsdurchsatz von mehr als 10 als die manuelle Sortierung von Puppen M Männer/Woche.

Die Freilassung nicht-transgener Männchen aus Kreuzungsprogrammen könnte in vielen Ländern tatsächlich angemessener sein als die Freilassung transgener Männchen, da die Freilassung von gentechnisch veränderten Mücken auf größeren öffentlichen Widerstand und regulatorische Einschränkungen stößt47. Daher können die Kosten im Zusammenhang mit öffentlichen Informations- und Konsultationskampagnen, der Einbindung von Interessengruppen und der Einhaltung regulatorischer Prozesse gesenkt werden. Diese Aspekte müssen berücksichtigt werden, da der Mangel an Information und Konsultation in der Vergangenheit zu einem so starken öffentlichen Widerstand geführt hat, dass einige Veröffentlichungsprogramme abgesagt werden mussten47. Bemerkenswert ist, dass die Rekombination in unseren GSSs zu einer Kontamination freigelassener Männchen durch nicht transgene bestrahlte Weibchen mit einer Rate führen würde, die der Rekombinationsrate entspricht. Allerdings wäre diese Freisetzung unfruchtbarer Weibchen im Vergleich zu aktuellen Methoden immer noch viel geringer.

COPAS-Sortierfehler während der Reinigung nicht-transgener Männchen waren in unseren Pilotversuchen äußerst selten. Aufgrund gelegentlicher technischer Probleme kann es jedoch zu solchen Kontaminationen kommen und würde zur Freisetzung eines kleinen Prozentsatzes transgener Mücken inmitten nicht-transgener Mücken führen. Dies sollte in Umgebungen, in denen GVO verboten sind, unbedingt vermieden werden. Ein zusätzlicher Qualitätskontrollschritt zur Entfernung aller verbleibenden GFP-fluoreszierenden Larven aus den sortierten Larven könnte durch einen zweiten COPAS-Lauf erreicht werden. Dies könnte auch durch eine visuelle Überprüfung der sortierten Larven insgesamt unter einem Fluoreszenzmikroskop erreicht werden, da GFP-Positive selbst bei vielen Wildtyp-Larven leicht zu erkennen und zu eliminieren sind. Bemerkenswert ist, dass GSSs mit einem m-verknüpften Fluoreszenzmarker eine weniger offensichtliche Geschlechtertrennung zeigen als M-verknüpfte GSSs. Die Kontamination der Geschlechtskreuzung mit für das Transgen homozygoten Weibchen führt jedoch zu transgenen Nachkommen, die anschließend bei der Sortierung der nicht-transgenen Männchen eliminiert werden. Außerdem verhindert die Bestrahlung aller Mücken vor der Freisetzung, dass die Transgene überhaupt in die Zielpopulation gelangen.

Obwohl sich diese Arbeit auf die Produktion von Aedes-Männchen für SIT konzentrierte, könnten die gleichen Verfahren zur Produktion von transgenen oder nicht-transgenen Männchen direkt in anderen Mückenkontrollansätzen wie IIT, RIDL, pgSIT oder anderen derzeit untersuchten genetischen Kontrollmethoden angewendet werden Entwicklung.

Zusammenfassend stellen die vier in dieser Arbeit entwickelten GSS vielversprechende Instrumente zur Verbesserung der Kosteneffizienz der Aedes-Massenaufzucht in genetischen Kontrollprogrammen dar. Laut unseren Pilottests im Labor könnte eine Anlage mit zwei COPAS-Maschinen in einem 7,5-Stunden-Regime 1.000.000 männliche Larven pro Tag produzieren. Wenn man bedenkt, dass keine Weibchen aufgezogen werden, würden die Platzbeschränkungen gelockert. Darüber hinaus würde diese Technik auch die Produktionskosten senken, die mit der Notwendigkeit verbunden sind, eine geringe oder gar keine weibliche Kontamination zu erreichen, was die Einhaltung lokaler Vorschriften erleichtert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die COPAS-Sortierung unserer GSS eine schnelle, kostengünstige und sichere Massenproduktion männlicher Mücken für SIT und andere genetische Kontrollmethoden ermöglichen würde, mit flexiblen Skalierungsmöglichkeiten entsprechend den lokalen Bedürfnissen, Ressourcen und Vorschriften.

Die Ae. Die Albopictus-Wildtyp-Kolonie (genannt BiA) wurde 2018 aus Larven gegründet, die in Bischheim (Frankreich, 48,36°N 07,45°E) gesammelt wurden. Ae. Aegypti aus dem genetischen Hintergrund von Bangkok, gewonnen aus MR4-BEI, wurden für das molekulare Klonen und die Gentechnik verwendet. Ae. Der aus Bangkok stammende Aegypti-Stamm BgR9, der Cas9 unter der Kontrolle des Exuperentia-Promotors und ein DsRed-Reportergen unter dem AePUb-Promotor exprimiert, wurde für CRISPR/Cas9-Knock-in-Experimente verwendet (Plasmidsequenz in Supplementary Data 4). Der Bra Ae. Der Stamm aegypti stammt aus Juazeiro, Brasilien und wurde dem IPCL 2012 von Biofabrica Moscamed, einem Kooperationszentrum der IAEA zur Entwicklung des SIT gegen Mücken, zur Verfügung gestellt. Es wurde zur Rückkreuzung der geschlechtsspezifischen Transgene verwendet.

Die Mücken wurden unter Standardbedingungen für Insekten gehalten (25–28 °C, 75–80 % relative Luftfeuchtigkeit, 14-Stunden-/10-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus). Die Larven wurden in quadratischen 35-cm-Pfannen in 1 l destilliertem Wasser aufgezogen und täglich mit gemahlenem TetraMin-Fischfutter gefüttert. Erwachsene Mücken wurden in 16 × 16 × 16 cm großen Käfigen gehalten und mit einer 10 %igen Zuckerlösung versorgt. Die Weibchen wurden mit anästhesierten Mäusen mit Blut gefüttert. Die Eier wurden auf feuchtes Kraftpapier gelegt und nach 3 Tagen ausgebrütet oder getrocknet.

Bei der Plasmidkonstruktion kamen molekularbiologische Standardverfahren zum Einsatz, darunter PCR-Amplifikation genomischer DNA mit Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (F530, Thermo Scientific, Frankreich), Klonierung mit NEBuilder® HiFi DNA Assembly (New England Biolabs, Frankreich) und GoldenGate-Klonierung in Ziel-Backbones unter Verwendung des Restriktionsenzyms Anza 36 Eco31I (Thermo Fisher Scientific, Frankreich), Transformation in kompetente Escherichia coli-Bakterien und Miniprep- oder Endo-Free Midiprep-Plasmidreinigungen (Macherey Nagel, Frankreich). Für CRISPR/Cas9-Knock-in im Ae. Aegypti M- und m-Loci verwendeten wir Plasmid pX4 bzw. pX3 als Reparaturspender (Supplementary Data 4, Addgene #183903 und #183904). Für die piggyBac-Integration in der Nähe des Ae. Albopictus M-Locus, der den Aal-M-Stamm ergab, verwendeten wir das Plasmid ppBAalbNixE1E3E4 PUb-YFP (Addgen #173666, beschrieben in26). Für die zufällige piggyBac-Insertion in der Nähe des m-Locus verwendeten wir das Plasmid ppBExu-Cas9-sv40, dessen lox-Kassette (umfassend Cas9 und PUb-DsRed) anschließend durch Injektion eines Plasmids, das Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von exprimiert, aus dem Genom herausgeschnitten wurde PUb-Promotor und ersetzt durch Einfügen des Plasmids pENTR-attB-PUb-GFP (Addgen Nr. 183911) in die attP-Stelle durch gemeinsame Injektion mit einem Plasmid, das Integrase aus dem Phagen PhiC31 (Addgen Nr. 183966) exprimiert.

Injektionsmischungen bestanden aus 400 ng/µL DNA in 0,5x PBS. piggyBac-Injektionsmischungen wurden wie in20 beschrieben hergestellt. Bei CRISPR-Cas-Knock-Ins wird die anfängliche Mischung in das BgR9 Ae injiziert. Die Cas9-exprimierende Linie von aegypti umfasste 84 µM gRNAs, 100 ng/µL Reparaturplasmid und 2 µM Scr7. Angesichts der sehr geringen Anzahl der erhaltenen Transgenen (1 Individuum von >20.000 gescreenten Larven) injizierten wir später das Reparaturdonorplasmid (190 ng/µL) mit 5 µM Scr7 und drei Plasmiden, die unterschiedliche gRNAs unter der Kontrolle verschiedener AeU6-Promotoren exprimierten ( 70 ng/µL jedes Plasmid). Diese Methode ergab deutlich höhere Knock-in-Raten (25 GFP-positive Larven von etwa 4000 gescreenten).

Die Embryo-Mikroinjektion wurde im Wesentlichen wie veröffentlicht unter Verwendung eines inversen Nikon Eclipse TE2000-S-Mikroskops, eines Eppendorf Femtojet-Injektors und eines TransferMan NK2-Mikromanipulators18 mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Die Eier wurden 3–8 Tage nach der Injektion ausgebrütet und die Larven im ersten Stadium wurden unter einem Nikon gescreent Im SMZ18-Fluoreszenzmikroskop wurden nur G0-Larven, die eine vorübergehende Expression des Reportergens zeigten, für die anschließende Auskreuzung zurückbehalten.

Um die Sexualorte gezielt anzusprechen, nutzten wir die Arbeit von Fontaine et al. Zeigt eine Gruppe von Markern innerhalb einer nicht rekombinierenden 63-Mbit/s-Region, die die Geschlechtsorte mit hoher genetischer Differenzierung zwischen Mann und Frau und männlicher Heterozygotie umfasst, die mit Y-Chromosomen-ähnlichen Null-Allelen übereinstimmen30 (Ergänzungstabelle 2). DNA-Sequenzen dieser Marker mit mutmaßlichen Y-verknüpften Null-Allelen wurden auf das zusammengesetzte AegL5-Genom27 gestrahlt, um eine 4,9-Mb-Region zu identifizieren, die sich von 160.092.339 bp bis 165.014.624 bp auf Chromosom 1 in der AegL5-Anordnung erstreckt. Innerhalb dieser nicht rekombinierenden Region haben wir das Gen AAEL019619 ausgewählt, das etwa 9 Mbp von Nix entfernt liegt. Wir haben das CRISPR/Cas9-System verwendet, um eine 2,3-kb-Fluoreszenzmarkerkassette (eGFP-Marker unter dem Ae. aegypti-Poly-Ubiquitin-Promotor – PUb) einzuschleusen, die von 850–960-bp-Homologiearmen flankiert wird, entweder innerhalb des fünften, 9-kb-Introns von dieses Gens (pX3-Konstrukt) oder um ein synthetisches Intron innerhalb von Exon 5 zu erzeugen (pX4-Konstrukt). Wir haben einen ersten M-verknüpften Stamm für Ae erhalten. aegypti nach der Injektion von 200 Eiern des BgR9-Stammes, der Cas9 unter der Kontrolle des Exuperentia-Promotors exprimiert, mit dem pX4-Reparaturplasmid und zwei synthetischen gRNAs (GATGAATCATGGGGCGCCT[GGG] und GATTCATCAATCAACGGAG[CGG], Klammern geben das Protospacer Adjacent Motif, PAM, an ). Etwa 30 G0-Larven, die eine vorübergehende GFP-Expression zeigten, wurden massenhaft mit einem Überschuss an Wildtyp-Mücken gekreuzt. Von mehr als 20.000 gescreenten G1-Larven wurde eine einzige transgene männliche Larve gefunden, bis zum Erwachsenenalter herangezogen und mit WT-Weibchen gekreuzt. Seine Nachkommen bestanden aus 100 % eGFP-positiven Söhnen und 100 % eGFP-negativen Töchtern, was auf eine M-Verknüpfung hinweist. Wir haben dies Ae genannt. aegypti M-verknüpfter Stamm Aaeg-M. Nach Injektion von 600 BgR9-Eiern mit dem pX3-Reparaturplasmid und einer Mischung aus drei Plasmiden, die gRNAs (GTGGCATAGCGCCGTGTGTGGA[GGG], GTCTTAAATGAAAGAGGCG[AGG], GTATCATGCGTATTGCGAG[AGG], Klammern zeigen das PAM) unter der Kontrolle von drei verschiedenen U6-Promotoren (gRNA) exprimieren Klonierungsvektoren: Ergänzende Daten 4) wurden 43 Larven mit vorübergehender eGFP-Expression in G0 gewonnen. Dabei wurden 20 Männchen und 20 Weibchen massenhaft mit Erwachsenen des anderen Geschlechts gekreuzt. Es wurden 25 transgene G1-Larven erhalten, von denen 10 Männchen mit einer M-verknüpften Insertion, 4 Männchen mit einer M-verknüpften Insertion und 11 Weibchen mit einer M-verknüpften Insertion waren. Die korrekte Insertionsstelle in AAEL019619 wurde durch PCR bei allen getesteten Personen bestätigt, was ergab, dass bei einigen dieser Mücken das gesamte Reparaturplasmid integriert war. Aus einem einzelnen Männchen ohne Plasmidrückgrat wurde ein Ae. Der Aegypti-M-verknüpfte Stamm mit dem Namen Aaeg-m wurde etabliert und weiter charakterisiert. Sowohl die Aaeg-M- als auch die Aaeg-m-Linie wurden über 7 Generationen hinweg in einen brasilianischen (Bra) genetischen Hintergrund zurückgekreuzt.

Nach mehreren erfolglosen Versuchen, einen Fluoreszenzmarker in der Nähe des Ae einzuschlagen. albopictus Nix-Gen mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems entdeckten, nutzten wir die häufige spontane Insertion in der Nähe des M-Locus von piggyBac-Transposonkonstrukten, die Nix-DNA-Sequenzen tragen, über die wir zuvor berichtet hatten26. Im Verlauf mehrerer Transgenese-Experimente unter Verwendung von piggyBac-Konstrukten, die Nix-Sequenzen tragen, erhielten wir 12 unabhängige transgene Insertionen mit offensichtlicher M-Verknüpfung des Transgenese-Reporters (100 % fluoreszierende Männer) zusätzlich zu mehreren Nix-exprimierenden maskulinisierten weiblichen Linien und zu nicht- M-verknüpfte, nicht maskulinisierende Einfügungen. Ab der dritten Generation wurden diese Linien amplifiziert, um ihre M-Verknüpfung zu bestätigen und ihre Rekombinationsrate abzuschätzen. Sechs Linien zeigten bis zur sechsten Generation keine Rekombination von mehr als 700 in jeder Linie gescreenten Individuen (Ergänzungstabelle 3). Die meisten anderen M-verknüpften Linien zeigten ebenfalls 100 % fluoreszierende Männchen, enthielten jedoch zusätzliche, nicht M-verknüpfte Mehrfachinsertionen und wurden verworfen. Basierend auf der Linienfitness und den COPAS-Profilen haben wir eine YFP-Linie namens Aal-M für die weitere Arbeit als Ae ausgewählt. albopictus M-verknüpfter Stamm. Zusätzliche mit OpIE2-GFP oder Pub-DsRed markierte M-verknüpfte Linien, die bisher keine Rekombination zeigen, eine attP-Andockstelle für die nachfolgende Transgenese tragen und zusätzliche GSSs darstellen, werden bisher ebenfalls beibehalten, wurden jedoch nicht weiter im Detail charakterisiert.

Wir haben zunächst versucht, einen m-verknüpften Fluoreszenzmarker zu erhalten, indem wir >120 zufällige piggyBac-Insertionen durchmusterten. Zu diesem Zweck haben wir unsere bestehende Ae-Sammlung gesichtet. albopictus transgene Linien für die m/M-Verknüpfung und konstruierte eine zusätzliche Bibliothek von piggyBac-Konstrukten, die verschiedene Fluoreszenzproteine ​​(eGFP, mTurquoise2, YFP oder DsRed) unter der Kontrolle von Promotoren exprimieren, die unterschiedliche Expressionsmuster zeigen (3xP3, OpIE2, Ae. aegypti PUb, Drosophila). melanogaster actin5C). Durch gemeinsame Multiplex-Injektionen dieser piggyBac-Plasmide erhielten wir Linien, die bis zu sechs verschiedene Insertionen trugen, was durch ihre Farben und Fluoreszenzmuster angezeigt wurde. Von den 40 untersuchten unabhängigen transgenen Gründer-Individuen (von denen die meisten mehrere Insertionen trugen) schienen nur zwei Insertionen m-verknüpft zu sein: eine trug ein OpIE2-mTurquoise2-Markergen mit einer Rekombinationsrate von etwa 3 %, die andere hieß m-albR9 , trug ein Cas9-Transgen mit einem DsRed-Reportergen und zeigte eine Rekombinationsrate von 0,1 %. Wir nutzten Letzteres aus, bei dem Transgene von zwei lox-Stellen neben einer attP-Andockstelle flankiert werden. Wir injizierten m-albR9-Eiern ein Plasmid, das für Cre-Rekombinase kodiert, um Cas9- und DsRed-Transgene herauszuschneiden, da Cas9 in einem GSS unerwünscht ist. Aus erfolgreich exzidierten Individuen haben wir eine m-verknüpfte attP-Dockinglinie, mX1, etabliert, die kein weiteres Transgen trägt. In einem zweiten Schritt wurde ein attB-haltiges Plasmid, das eine PUb-eGFP-Markerkassette trägt, in die attP-Stelle integriert. Die m-Verknüpfung dieses neuen Stamms wurde durch Kreuzung von eGFP-Männchen mit WT-Weibchen und Screening ihrer Nachkommen verifiziert. Der neue Ae. Die m-verknüpfte Linie von albopictus mit dem Namen Aal-m wurde hemi/homozygot gemacht und amplifiziert.

Die automatisierte Sortierung von L1-Larven in Abhängigkeit von ihrem Fluoreszenzniveau wurde mit einem Großobjekt-Durchflusszytometer namens Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS SELECT; Union Biometrica, Belgien) in der veröffentlichten Fassung16 mit der bereitgestellten Biosort-Software durchgeführt. Die Sortiergenauigkeit wurde unter einem Nikon SMZ18 Fluoreszenzmikroskop kontrolliert.

Um die genaue Anzahl der Larven in COPAS-Clustern zu bestimmen, haben wir einen Clustering-Algorithmus entwickelt, der auf einem manuellen Ausreißer-Screening der Partikelgröße und Fluoreszenzverteilung sowie einem automatisierten Clustering-Algorithmus basiert. Die gesamte Datenverarbeitung und statistischen Berechnungen wurden mit der R-Statistiksoftware Version 4.1.048 durchgeführt. Alle für dieses Projekt verwendeten R-Skripte finden Sie auf Zenodo49. Kurz gesagt, COPAS-Rohdaten wurden vom Benutzer durch visuelle Untersuchung der Größenmessungen der Individuen (dh „log(EXT)“ und „log(TOF)“) gefiltert, um Ausreißer (z. B. Eierreste und Staub) zu entfernen. Eine zweite Filterung wurde auf den beiden ersten Achsen einer Primärkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, die auf die Größenvariablen (EXT und TOF) angewendet wurde. Ein dritter manueller Filter wurde durch Untersuchung der Fluoreszenz der Personen angewendet (dh „log(erste Fluoreszenz)“ und „log(zweite Fluoreszenz)“). Eine abschließende Filterung wurde an den beiden ersten Achsen einer PCA durchgeführt, die auf Fluoreszenzvariablen angewendet wurde. PCA-Analysen wurden mit der R-Funktion „prcomp“ aus dem Paket „stat“48 durchgeführt und die PCA-Ausgaben wurden mit dem R-Paket „factoextra“50 extrahiert. Gefilterte Daten wurden mithilfe der R-Funktion „kmeans“ aus dem R-Paket „stat“48 geclustert. Die Daten wurden mit den R-Paketen „ggplot2“ und „ggpubr“51,52 aufgezeichnet.

Genomische DNA wurde mit dem NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit (T3060, New England Biolabs, Frankreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen extrahiert: Nach Zugabe von Isopropanol wurde präzipitierte DNA direkt auf einer Pipettenspitze aufgefangen und in ein neues Röhrchen überführt 550 µl Waschpuffer und dann in ein letztes Röhrchen mit 70 % Ethanol füllen. Die DNA wurde bis zur Verwendung in 70 % Ethanol bei 4 °C gelagert. Am Tag der Verwendung wurde das Ethanol entfernt und die DNA in Wasser bei 37 °C unter Rühren bei 500 U/min und vorsichtigem Pipettieren resuspendiert. Anschließend wurde die DNA-Konzentration mit einem Nanodrop One-Gerät (Ozyme, Frankreich) gemessen.

Die Sequenzierungsmethode wurde vom Nanopore Cas9 Targeted Sequencing (nCATS) übernommen53. gRNAs wurden in der bekannten Transgenregion ausgewählt, wobei ihre PAMs in Richtung der unbekannten zu bestimmenden Genomsequenz zeigten. Diese Ausrichtung gewährleistete die bevorzugte Ligation von Nanoporenadaptern an interessierenden DNA-Strängen.

Die Adapterligatur und die Bibliotheksvorbereitung wurden mit dem LSK109-Kit (Oxford Nanopore Technologies, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Bibliothek wurde auf Flongle-Durchflusszellen geladen. Sequenzierung, Basecalling und Ausrichtung der Reads auf das Transgeneseplasmid wurden mit der bereitgestellten Software MinKNOW v. 21.06.10 (Oxford Nanopore Technologies, UK) durchgeführt. Lesevorgänge, die Homologie zu den Transposonenden zeigten, wurden dann mit ClustalW auf der Geneious-Software v9.1.854 mit der Transposonsequenz abgeglichen und eine oder mehrere Konsenssequenzen bestimmt. Abschließend wurden die Konsensussequenzen mithilfe des Online-Dienstes NCBI BLAST55 mit Genomdaten verglichen.

Mit dieser Methode konnten wir die Insertionsstelle des Aal-m-Transgens bestimmen. Wir erhielten nur zwei Lesevorgänge von geringer Qualität, die sich um etwa 20 kb in die Genomsequenz neben dem Transgen erstreckten, aus der wir eine Reihe von PCR-Primern entwarfen. Die Sanger-Sequenzierung von PCR-Produkten, die sich über die Transposon/Genom-Verbindung erstrecken, ermöglichte uns die Verfeinerung von 1647 bp der flankierenden Sequenz, bereitgestellt in Supplementary Data 1. Die Analyse dieser Sequenz mit NCBI BLAST zeigte nur eine teilweise Ausrichtung auf Sequenzen des AalbF2-Genoms32, was vermutlich a entspricht repetitives Element, was darauf hindeutet, dass die m-verknüpfte Region, in die das Transgen eingefügt wurde, in den verfügbaren Genomassemblierungen nicht vertreten ist.

In transgenen Linien wurde das Geschlechterverhältnis durch COPAS-Zählung der Larven jeder Fluoreszenz gemessen. In nicht-transgenen Linien (BiA und Bra) züchteten wir Proben bis zum Puppenstadium und zählten Männchen und Weibchen unter einem Binokularmikroskop anhand der Genitaluntersuchung. Für alle Linien wurden N = 3 biologische Replikate erstellt.

Um die Fruchtbarkeit zu gewährleisten, durften sich Männchen und Weibchen mehrere Tage lang paaren. Den Käfigen wurde dann eine Blutmahlzeit angeboten und vollgestopfte Weibchen wurden ausgewählt. Nach zwei Tagen wurden die geschwollenen Weibchen kurzzeitig mit CO2 anästhesiert und einzeln für zwei Tage in Platten mit 24 Vertiefungen gelegt, die mit nassem Filterpapier beschichtet waren. Anschließend wurden die Weibchen freigelassen und jede Vertiefung wurde unter einem Zeiss SteREO-Binokularmikroskop fotografiert. Die von jedem Weibchen gelegten Eier wurden mit der ImageJ-Software56 gezählt.

Die Brutrate der Eier wurde an Eiproben gemessen, die aus N = 3–5 Käfigen jeder Linie entnommen, unter einem Zeiss SteREO-Binokularmikroskop fotografiert und mit der ImageJ-Software gezählt wurden56. Die Eier wurden in Wasser getaucht, für 20 bis 30 Minuten in eine Vakuumkammer gelegt und über Nacht schlüpfen gelassen. Am nächsten Morgen wurden die Larven mit COPAS gezählt.

Das Überleben von der Larve bis zum Erwachsenen wurde gemessen, indem N = 4–8 Proben von 100–200 L1-Larven mittels COPAS sortiert und bis zum Erwachsenenalter aufgezogen wurden. Die Anzahl der aus jeder Charge hervorgehenden Erwachsenen wurde manuell gezählt.

Die Konkurrenzfähigkeit der Männchen wurde beurteilt, indem 30 transgene Männchen mit 30 nicht-transgenen Männchen in einen Käfig mit 30 Weibchen gesetzt und der Anteil der transgenen Nachkommen in ihren Nachkommen gemessen wurde. Wenn beide Arten von Männchen eine ähnliche Fitness aufweisen, wird erwartet, dass die Nachkommen zu etwa 25 % aus transgenen Individuen bestehen (transgene Väter sind homozygot), korrigiert um das Geschlechterverhältnis der Linie. Die relative Wettbewerbsfähigkeit wurde durch Vergleich des beobachteten Anteils transgener Nachkommen mit dem theoretischen Wert in N = 4 oder N = 5 Replikaten geschätzt.

Die Flugfähigkeit der Männchen wurde wie beschrieben mit einem Flugtestgerät (FTD) bewertet33. Die Tests wurden an Pools von etwa 100 Männern mit N = 3 Wiederholungen für jede Bedingung durchgeführt. Pools von Männchen wurden in einem dichten Becher am Boden mehrerer vertikaler Röhren platziert, auf denen ein Ventilator angebracht war. Um dem engen Becher zu entkommen, müssen sie gegen den vom Ventilator verursachten Luftstrom die vertikalen Rohre hinauffliegen. Nach zwei Stunden wurde die Anzahl der entkommenen Männchen im Vergleich zu der Anzahl der nicht entkommenen Männchen gezählt und die Fluchtraten zwischen den Stämmen verglichen.

Das 2-Wochen-Überleben der Männchen wurde gemessen, indem die tägliche Anzahl der Todesfälle in N = 4–8 Käfigen mit etwa 100 Männchen jeder Linie über 14 Tage gezählt wurde.

Die Kosteneffizienzanalysen wurden durchgeführt, indem die Ergebnisse des „FAO/IAEA INTERACTIVE SPREADSHEET FOR DESIGNING MOSQUITO MASS REARING AND MALE HANDLING FACILITIES“34 für verschiedene wöchentliche Produktionsziele mit denen seiner angepassten Versionen unter Berücksichtigung der Verwendung von einem oder zwei GSS verglichen wurden GSS kombiniert zum Sortieren nicht-transgener Männchen (siehe Schema in Zusatzdaten 3). Kurz gesagt, diese neuen Tabellenkalkulationen wurden in ähnlicher Weise wie die ursprüngliche erstellt, enthalten jedoch die GSS-spezifische Struktur, die zuvor bei Fruchtfliegen entwickelt wurde und separate Filter- und Aufzuchtkolonien umfasst36. In den Filterkolonien werden die Larven im ersten Stadium mit COPAS sortiert und im Puppenstadium noch einmal mit einem klassischen Puppensortierer sortiert. Diese Kolonien produzieren in jeder Generation die Eier, die die Aufzuchtkolonien ernähren. In einem einzelnen GSS-Szenario wird die Aufzuchtkolonie nach L1 sortiert, um die freizusetzenden Männchen zu produzieren. In einem GSS-CS-Szenario produzieren zwei separate Filterkolonien die Eier für ihre jeweilige Aufzuchtkolonie, die wiederum sortiert und gepaart werden, um die Eier zu produzieren, die als L1-Eier ausgebrütet und nach Geschlecht sortiert werden, damit sie nur für männliche Tiere freigelassen werden. In diesen Szenarien werden bei jeder Generation Filterkolonien eingesetzt, was trotz einer höheren Rekombinationsrate schonender ist als bei Fruchtfliegen36. Eingabeparameter können in den Zusatzdaten 3 abgelesen werden. Bemerkenswert ist, dass die in der Tabelle genannten Kosten in Euro (€) angegeben und im Juli 2022 aktualisiert wurden. Bei diesen Kosten handelt es sich um durchschnittliche Beobachtungen aus europäischen SIT-Untersuchungen, die von IAEA-Forschern überarbeitet wurden. Um nachgelagerte Analysen zu erleichtern, wurden diese Excel-Tabellen in eine R48-Funktion übersetzt. Diese Funktion nutzt gängige R-Base48-Funktionen sowie Funktionen aus den Paketen „purrr“ und „tidyverse“57. Es wurde dauerhaft auf Zenodo49 hinterlegt. Die Produktionskosten wurden in US-Dollar ($) umgerechnet.

Alle statistischen Datenanalysen wurden mit der R-Statistiksoftware Version 4.1.048 durchgeführt. Die für diese Studie verwendeten R-Skripte sind auf Zenodo49 zu finden.

Der Unterschied im Geschlechterverhältnis und der Eischlüpfrate zwischen den Linien jeder Art wurde unter Verwendung des verallgemeinerten Modells mit Binomialverteilung und Normalitätsannahme der Residuenverteilung (R-Funktion „glm“48) modelliert, und der paarweise Vergleich der Linien wurde unter Verwendung eines Tukey-HSD getestet test (R-Funktion 'glht'58). Der Unterschied in der Fruchtbarkeit (Anzahl der pro Weibchen gelegten Eier) zwischen den Linien jeder Art wurde mithilfe eines Hürdenmodells mit einer negativen Binomialverteilung modelliert. Die Signifikanz des Hürdenmodells wird in zwei Teilen ermittelt: Der erste Teil ist die Wahrscheinlichkeit, den Wert 0 zu erreichen, und der zweite Teil ist die Wahrscheinlichkeit der Werte ungleich Null. Die Unterschiede im Larvenüberleben zwischen den Linien jeder Art wurden mithilfe linearer Modelle mit der Annahme einer Restverteilungsnormalität (R-Funktion „lm“48) modelliert und mithilfe eines Tukey-HSD-Tests (R-Funktion „TukeyHSD“48) getestet. Der Unterschied in der Konkurrenzfähigkeit und Flugfähigkeit der Männchen zwischen den Linien jeder Art wurde unter Verwendung des verallgemeinerten Mixed-Effect-Mod mit Binomialverteilung und Normalverteilungsannahme der Residuen (R-Funktion „glmer“ aus dem Paket „lme4“59) modelliert, wobei technische Replikate vorhanden waren als Zufallsfaktor festgelegt. Paarweise Vergleiche zwischen Linien wurden mit einem Tukey-HSD-Test (R-Funktion „glht“) getestet. Das Überleben männlicher Erwachsener während der ersten 14 Tage wurde mithilfe von Cox-Regressionen und der Kaplan-Meir-Formel modelliert (Funktion aus den R-Paketen „survminer“, „survival“60,61,62). Unterschiede im Überleben nach 7 und 14 Tagen wurden mithilfe linearer Modelle mit der Annahme einer Normalverteilung der Residuen (R-Funktion „lm“) modelliert und mithilfe eines Tukey-HSD-Tests (R-Funktion „TukeyHSD“) getestet. Die Modellleistungen wurden mithilfe der R-Funktion „check_model“ aus dem Paket „performance“63 bewertet. Die verwendeten Pakete, Datenverarbeitungsverfahren, Modellstruktur, Passform und Leistungen finden Sie in Supplementary Data 2.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Plasmidsequenzen sind in Supplementary Data 4 verfügbar. Plasmide sind bei Addgene unter den Referenznummern #173666, #183903, #183904, #183911, #183912, #183913, #183914 und #183966 erhältlich. Mückenstämme sind auf Anfrage bei EM erhältlich. Die Quelldaten zur Erstellung der Diagramme in den Abb. 3 und 4 finden Sie in den Zusatzdaten 2. Die Quelldaten für Abb. 5 finden Sie in den Zusatzdaten 3 (Abschnitt „Anfangsparameter“). Datensätze können auch von Zenodo49 heruntergeladen werden. Weitere Informationen können auf begründete Anfrage bei den jeweiligen Autoren eingeholt werden.

Die R-Funktion zur Replikation aller vier Tabellenkalkulationen, der COPAS-Analysecode und der Code zur Replikation unserer statistischen Analysen sind auf Zenodo49 verfügbar. Alle anderen in dieser Studie verwendeten Codes sind auf begründete Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. H. Maiga und Dr. W. Mamai von der Internationalen Atomenergiebehörde (Wien, Österreich) für die Überarbeitung der SIT-bezogenen Kosten, Nathalie Schallon und Amandine Gautier für die Insektenoperation und Dr. Stéphanie Blandin für Kontinuierliche Unterstützung und wissenschaftliche Diskussion.

Diese Studie wurde durch den EU-ERC-Zuschuss CoG-682387 REVOLINC an JB finanziert. Der Inhalt dieser Veröffentlichung liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die Ansichten der Europäischen Kommission wider. Die Mückenproduktion und der Betrieb des Insektariums wurden durch das Stipendium #ANR-11-EQPX-0022 der Agence Nationale de la Recherche und den dreijährigen Vertrag „Strasbourg Capitale Européenne“ 2019–2021 unterstützt. Ein Teil der Mückenexperimente wurde auf der Insektariumsplattform Baillarguet durchgeführt, die Mitglied der Nationalen Infrastruktur EMERG'IN und des Vectopole Sud-Netzwerks ist (http://www.vectopole-sud.fr/). Die Baillarguet-Insektariumsplattform wird von den gemeinsamen Einheiten Intertryp (IRD, Cirad) und ASTRE (Cirad, INRAE) geleitet. EM erhielt Mittel von der Agence Nationale de la Recherche durch die Zuschüsse #ANR-19-CE35-0007 GDaMO und #18-CE35-0003-02 BAKOUMBA. RB wurde durch das von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderte Internationale Graduiertenkolleg TreeDì unterstützt – 319936945/GRK2324. OSA wurde durch NIH-Auszeichnungen (R01AI151004, 5R21AI156018, 5RO1AI148300) unterstützt.

Alle Figuren wurden auf BioRender.com unter kostenpflichtiger Lizenz entworfen.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Jérémy Bouyer, Eric Marois.

CIRAD, UMR ASTRE, F-34398, Montpellier, Frankreich

Célia Lutrat, Thierry Baldet und Jérémy Bouyer

ASTRE, CIRAD, INRA, Univ. Montpellier, Montpellier, Frankreich

Celia Lutrat

Universität Montpellier, Montpellier, Frankreich

Celia Lutrat

CNRS UPR9022, INSERM U1257, Universität Straßburg, Straßburg, Frankreich

Celia Lutrat, Myriam Burckbuchler, Roenick Proveti Elm und Eric Marois

Deutsches Zentrum für integrative Biodiversitätsforschung (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, Puschstraße 4, 04103, Leipzig, Deutschland

Remy Beugnon

Institut für Biologie, Universität Leipzig, Puschstraße 4, 04103, Leipzig, Deutschland

Remy Beugnon

Abteilung für Parasitologie und Entomologie, Abteilung für Mikrobiologie und Infektionskrankheiten, Army Biomedical Research Institute (IRBA), Marseille, Frankreich

Albin Fontaine

School of Biological Sciences, Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie, University of California, San Diego, CA, 92093, USA

Omar S. Akbari

Cicindela Ltd, Valencia, Spanien

Rafael Argilés-Herrero

CIRAD, UMR ASTRE, Sainte-Clotilde, F-97490, Réunion, Frankreich

Thierry Baldet

CIRAD, UMR ASTRE, Saint-Pierre, F-97410, Réunion, Frankreich

Jérémy Bouyer

Unterprogramm zur Schädlingsbekämpfung, Gemeinsame FAO/IAEA-Abteilung für Nukleartechnik in Ernährung und Landwirtschaft, Internationale Atomenergiebehörde (IAEA), Wien, Österreich

Jérémy Bouyer

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Von CL, TB, JB und EM konzipierte Forschung. AF trug zu den Genomdaten bei. CL, MB, RPO und EM führten Untersuchungen durch. CL, RPO, RB, AF, OSA, RAH und EM analysierten Daten. RB und RAH steuerten Analysetools bei. CL hat das Papier mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Célia Lutrat oder Eric Marois.

OSA ist Mitbegründer von Agragene, Inc. und Synvect, Inc. mit einer Kapitalbeteiligung. Die Bedingungen dieser Vereinbarung wurden von der University of California, San Diego im Einklang mit ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und genehmigt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Wir unterstützen eine inklusive, vielfältige und gleichberechtigte Durchführung der Forschung. Die Tierpflege entsprach den CNRS-Richtlinien und wurde von der CREMEAS-Ethikkommission genehmigt.

Communications Biology dankt Nikolai Windbichler, Benjamin Matthews und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Anam Akhtar und Gene Chong. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lutrat, C., Burckbuchler, M., Olmo, RP et al. Die Kombination zweier genetischer Geschlechtsstämme ermöglicht die Sortierung nicht-transgener Männchen für die genetische Kontrolle von Aedes. Commun Biol 6, 646 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05030-7

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Eingegangen: 22. Februar 2023

Angenommen: 08. Juni 2023

Veröffentlicht: 16. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05030-7

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